Herstellung infektiöser in vitro Transkripte und Volllängen cDNA Klone von Apple stem pitting virus (ASPV) und Apple stem grooving virus (ASGV) und Untersuchungen zur jahreszeitlichen Nachweisbarkeit dieser Viren im Apfelbaum

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte ein infektiöser Volllängen cDNA Klon des Apple stem pitting virus (ASPV) hergestellt werden, mit dem die Ätiologie der hervorgerufenen Krankheitsbilder untersucht werden kann. Dazu sollte zum einen die klassische Methode der Ligationsstrategie genutzt werden. Sie basiert auf spezifischen Restriktionsschnittstellen mit deren Hilfe das Genom aus mehreren Fragmenten im Zielvektor zusammengesetzt wird (Prüfer et al. 1995). Für diese Methode ist es unerlässlich die komplette Sequenz des Virus zu kennen, um die Restriktionsschnittstellen auswählen zu können. Zum anderen sollte eine Methode entwickelt werden, die weniger zeit- und kostenintensiv ist und die Probleme, die in der Ligationsstrategie auftreten können, umgeht. Dazu gehört die hohe Sequenzvariabilität, die bei den latenten Apfelviren auftritt, welche dazu führt, dass das verwendete Isolat vorher sequenziert werden muss (Yoshikawa 2009). Des Weiteren können die während der Ligationsstrategie entstandenen Konstrukte in den Bakterien instabil oder toxisch sein (Ülper et al. 2008). Die entwickelte Methode sollte auf das Apple stem grooving virus (ASGV) angewendet werden. Für die Herstellung eines Volllängen cDNA Klons des ASPV wurde das Isolat PB66 verwendet. Die Ligationsstrategie wurde mit Hilfe der Sequenz des Isolates PA66 entwickelt. Bereits während der Amplifikation mittels Polymerase Kettenreaktion (PCR) traten Probleme auf, die dazu führten, dass die komplette Sequenz des Isolates PB66 bestimmt wurde. Dabei stellte sich heraus, dass die beiden Isolate eine Sequenzidentität von 80 % haben. Anhand der neuen Sequenz wurde eine Ligationsstrategie entwickelt, mit der erfolgreich ein Volllängen cDNA Klon des ASPV unter der Kontrolle des 35S Promotors hergestellt werden konnte. Das Konstrukt wurde in einem weiteren Schritt in einen pBin Vektor umligiert. In den anschließenden Infektionsversuchen mittels mechanischer Inokulation und Agroinokulation war dieser nicht infektiös. Die Sequenzierung des entstandenen Volllängen cDNA Klons zeigte ein verändertes 5'- Ende und 19 weitere Basenaustausche innerhalb der Sequenz. Als weitere Methode sollte die Volllängen PCR genutzt werden, dazu wurden Primer am 5'- und 3'- Ende des ASPV Isolates PB66 abgeleitet. Beim Vergleich von 5'- und 3'- Enden von verschiedenen ASPV Isolaten konnte eine erhöhte Konserviertheit festgestellt werden, welche es ermöglicht, die erstellten Primer zur Herstellung von 15 Volllängen PCR Produkten von verschiedenen ASPV Isolaten zu nutzen. In der PCR konnte das komplette Genom amplifiziert werden. Die Ligation des 9 kb großen PCR Fragmentes gelang nicht. Als Abänderung in der Volllängen PCR wurde dem 'forward' Primer die Sequenz des T7 Promotors angefügt. Dadurch konnten in der T7 PCR infektiöse RNA Transkripte generiert werden. Die Volllängen PCR wurde auf ASGV angewendet. Es konnte das komplette 6,5 kb große Genom amplifiziert werden. Die Ligation des PCR Produktes war auch hier nicht erfolgreich. Durch Hinzufügen des T7 Promotors an den 'forward' Primer konnten mit den Volllängen PCR Produkten in der T7 PCR infektiöse Transkripte hergestellt werden. Durch mechanische Inokulation mit den T7 PCR Ansätzen konnten in beiden Fällen in dem experimentellen Wirt Nicotiana occidentalis 37B Symptome ausgelöst werden. Die Infektion mit ASPV und ASGV wurde durch PCR Nachweise und elektronenmikroskopische Untersuchungen belegt. Als weitere Methode wurde das Circular Polymerase Extension Cloning (CPEC) verwendet (Quan and Tian 2009). Hierbei wurde an die Primer für die Volllängen PCR ein Stück Vektorsequenz angehängt. Diese überlappenden Bereiche dienen in einer Fusions- PCR als Ausgangspunkt für die Polymerase. Mit Hilfe dieser Methode konnten infektiöse Volllängen cDNA Klone des ASPV und ASGV in einem pBin Vektor hergestellt werden. Nach Agroinokulation zeigten sich auf den Versuchspflanzen Symptome. Die Infektion wurde durch PCR und das Elektronenmikroskop belegt. Die Infektionsrate lag bei dem ASPV Klon bei 3 % und bei dem ASGV Klon bei 22 %. In dieser Arbeit wurden infektiöse Volllängen cDNA Klone der latenten Apfelviren ASPV und ASGV mit der CPEC Methode hergestellt. Beide Klone könnten in weiteren Versuchen für die Erforschung der Ätiologie der durch die Viren hervorgerufenen Krankheiten genutzt werden. Des Weiteren wurde ein Versuch zur Nachweisbarkeit von ASPV über den gesamten Jahresverlauf in verschiedenen\ud Apfelbaumgeweben durchgeführt, in dem sich Phloem als das zuverlässigste Gewebe zur Detektion von ASPV gezeigt hat. Die Nachweisbarkeit von ASPV, Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV) und ASGV in Mischinfektionen wurde ebenfalls über einen längeren Zeitraum überprüft