Differentielle DNA Methylierung und Analysen zum Transkriptionsfaktor hoxA9 in CD34+ hämatopoetischen Vorläuferzellen

Stammzellen definieren sich durch die duale Fähigkeit, sich einerseits selbst zu erneuern (Self-renewal) und andererseits verschiedene spezialisierte Zelltypen hervorbringen zu können (Differenzierung). Im Organismus sind vor allem adulte Stammzellen für die lebenslange Regeneration der verschiedensten Gewebe verantwortlich. Doch auch sie unterliegen, wie alle somatischen Zellen, dem Prozess der Alterung. Im Laufe der Zeit verlieren sie ihre Pluripotenz und die Fähigkeit zum Selbsterhalt. Hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HPC) stellen die bis jetzt am besten charakterisierten und untersuchten adulten Stammzellen dar. Sie sind verantwortlich für die lebenslange Erneuerung des hämatopoetischen Systems und befinden sich in spezialisierten Nischen im Knochenmark. In diesem Zusammenhang wurde in dieser Arbeit die Hypothese untersucht, dass Gene, welche für die Selbsterneuerung von humanen hämatopoetischen Vorläuferzellen (HPC) notwendig sind, mit zunehmendem Alter und ihm Rahmen der Differenzierung durch DNA-Methylierung dauerhaft epigenetisch stillgelegt werden. Dazu wurden zunächst humane CD34+ HPC von Spendern verschiedener Altersgruppen (0 Jahre und 35 Jahre) und zudem differenzierte Granulozyten und Monozyten mittels spezifischer Oberflächenantigene isoliert. Von allen Proben wurde anschließend genomweit der Methylierungsstatus von 27.578 CpG Dinukleotiden aus den Promotorregionen von über 14.000 Genen per Infinium Human Methylation Bead Chip27 bestimmt und analysiert. Eine Validierung der Daten erfolgte mittels 454 Pyrosequenzierung. Insgesamt zeigen die Untersuchungen in den HPCs deutliche altersassoziierte Methylierungsunterschiede, die auch zu funktionellen Veränderungen führen können. Bei einer minimalen Methylierungsdifferenz von 15% weisen 192 CpG Dinukleotide eine deutliche Hypermethylierung, 350 CpG-Dinukleotide dagegen eine Hypomethylierung bei Erwachsenen im Vergleich zu Neugeborenen auf. Auch das Methylierungsmuster der myeloiden Differenzierungen, also der Vergleich von CD34+ HPCs zu Granulozyten und Monozyten, zeigt eine deutlich gerichtete Hypomethylierung im Vergleich zu undifferenzierten Stammzellen. Diese konnte durch Signalweganalysen auch in einen funktionellen Zusammenhang gestellt werden, was zeigt, dass myeloid assoziierte Gene im Laufe der Differenzierung demethyliert und dadurch aktiviert werden. Interessanterweise lassen sich zwischen den altersassoziierten Hypomethylierungen in den HPCs und der Hypomethylierung der myeloiden Differenzierung signifikante Übereinstimmungen finden, was darauf hinweist, dass die in der Literatur beschriebene myeloide Restriktion im Verlauf der Stammzellalterung auch auf dem Methylierungsmuster basiert. Dies wird zudem noch durch de novo Methylierungen im Vergleich der „jungen“ und „alten“ CD34+ Zellen untermauert. In einem weiteren Teil der Arbeit wurden einzelne Gene auf ihre Funktion und Regulation in hämatopoetischen Vorläuferzellen untersucht. Für den homeobox Transkriptionsfaktor und Onkogen hoxA9, der eine wichtige Rolle bei der Selbsterneuerung von hämatopoetischen Stammzellen und der Leukemogenese spielt, konnte eine sehr hohe Promotormethylierung in der leukämischen Zelllinie HL60 nachgewiesen werden. Diese korreliert mit einer sehr geringen hoxA9 Genexpression, wobei die Promotormethylierung durch demethylierende Agenzien herabgesetzt und die Expression reaktiviert werden kann. In primären Zellen konnten große Expressionsunterschiede von hoxA9 im Verlauf der hämatopoetischen Differenzierung gemessen werden, wobei die mRNA Menge des Transkriptionsfaktors im Laufe der myeloiden und lymphoiden Differenzierung kontinuierlich abnimmt. Funktionelle Effekte dieser Veränderungen auf das Selbsterneuerungsprofil der humanen HPCs wurden mittels Koloniebildenden Assays und siRNA Transfektionen untersucht. Diese zeigen deutlich, dass das Stammzellpotential der HPC durch eine reprimierte hoxA9 Genexpression reduziert wird. Dabei konnte allerdings kein Zusammenhang zu Alterung und Methylierung in gesunden primären Zellen hergestellt werden. Insgesamt konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass HPCs im Rahmen der Alterung und Differenzierung molekularen und funktionellen Veränderungen unterliegen, welche zum Teil auf einer differentiellen DNA-Methylierung basieren. Ein genaueres Verständnis dieser molekularen Mechanismen der Alterung und der Genexpression in hämatopoetischen Stammzellen könnte zur Identifikation eventueller Risikofaktoren für Erkrankungen des Knochenmarks und zu innovativen Therapieansätzen, auch im Rahmen der allogenen Stammzelltransplantation, führen