Funktionelle Studien zur Signaltransduktion von Klotho

Klotho ist ein Typ I Transmembranprotein, das als solches oder nach Abspaltung seiner extrazellulären Domäne als sezernierter löslicher Faktor eine Rolle in einer Vielzahl an Signaltransduktionwegen spielt. So kann Klotho z.B. die Wirkung von Wachstumsfaktoren, wie FGF23, Insulin, IGF1 und Wnt modulieren. Über einen bisher ungeklärten Mechanismus hemmt Klotho die Phosphorylierung des IGF1R und damit den nachgeschalteten PI3-Kinase/Akt-Signalweg. Da der IGF1R ein validiertes Target für die Krebstherapie ist und es Hinweise auf eine Funktion von Klotho als Tumorsupressor gibt, könnte Klotho selbst oder ein synthetischer Klothorezeptor-Agonist ein vielversprechendes Therapeutikum für die zukünftige Behandlung maligner Tumore darstellen. Grundvoraussetzung für derartige Ansätze ist jedoch ein besseres Verständnis der Klotho-vermittelten Signaltransduktion und die Identifizierung aller Klothorezeptoren. In dieser Arbeit wurde daher die Inhibition des IGF1-Signalweges durch Klotho näher untersucht. Als erstes wurden hierzu adäquate Modellsysteme identifiziert und eine Reihe von Werkzeugen, u.a. verschiedene Klothovarianten, hergestellt. Mit Hilfe einer Liganden-Affinitätschromatographie sowie eines gezielten „Screenings“ einer „Orphan“ GPCR Rezeptorbibliothek sollte dann ein Rezeptor für Klotho identifiziert werden, der nach Bindung von Klotho die Inhibition der IGF1-Signaltransduktion vermittelt. Für diese Zwecke und weitere pharmakologische Studien wurde die extrazelluläre Domäne von Klotho mit einem Fc-„Tag“ kloniert, in CHO-Zellen stabil exprimiert und Klotho-Fc aus dem Überstand dieser Klone gereinigt. Trotz der nachgewiesenen biologischen Aktivität und einer robusten, salzstabilen zellulären Bindung von Klotho-Fc an ausgewählte Zellen konnte weder in affinitätschromatographischen „Pull-Down“-Experimenten noch im „Orphan-Screen“ ein spezifischer Interaktionspartner bzw. Rezeptor von Klotho identifiziert werden. In einem parallelen Ansatz wurde eine im Laufe dieser Arbeit von Wolf et al. (2007) neu beschriebene Bindung der Transmembranform von Klotho an den IGF1R untersucht und geklärt, ob eine solche Bindung auch für die lösliche extrazelluläre Domäne von Klotho besteht, da diese Domäne allein die Inhibition der IGF1-Signaltransduktion vermittelt. Es konnte jedoch weder mittels Co-Immunpräzipitation bzw. „Pull-Down“ die Bindung der Transmembranform an den IGF1R uneingeschränkt verifiziert noch mit Hilfe von Co-Immunpräziptation, Analysen mittels Durchflusszytometrie und Biacore-Experimenten Hinweise auf eine Bindung der extrazellulären Domäne gefunden werden. Daher besteht weiterhin die Annahme, dass die Inhibition des IGF1-Signalweges nicht über den IGF1R sondern einen bisher unbekannten Klothorezeptor vermittelt wird. Zusätzlich durchgeführte Microarray-Studien mit Klotho-sensitiven Zellen konnten zwar keine unmittelbaren Hinweise auf den gesuchten putativen Klothorezeptor geben, zeigten jedoch eine signifikante Induktion einer Vielzahl Zellzyklus-assoziierter Gene durch Klotho, die in dieser Weise und diesem Umfang bisher nicht bekannt war. Mit 81 dieser Gene konnte mit Hilfe der MetaCore Software ein fundiertes Netzwerk erstellt werden, das funktionelle Interaktionen zwischen den einzelnen Genen bzw. Proteinen aufzeigt. Diese Ergebnisse bieten neue Einblicke in die Funktion von Klotho in der Tumorentstehung und -progression und eine interessante Grundlage für weitere Studien