Entwicklung hochempfindlicher Protease- und DNA-Nachweisverfahren für den Einsatz in der Krebsforschung und medizinischen Diagnostik

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung hochempfindlicher Nachweisverfahren für proteolytische Enzyme. Viele Proteasen nehmen Schlüsselfunktionen in den Metastasierungsprozessen ein, dem größten Problem bei der Behandlung von Krebs. Sensitive Nachweismethoden für proteolytische Aktivität tragen zu einem tiefergehenden Verständnis der bei der Entstehung von Tochtergeschwüren beteiligten proteolytischen Prozesse bei und ebnen somit den Weg zur Entwicklung effektiver Antitumormedikamente. Unter Verwendung modifizierter natürlicher Proteine als Proteasesubstrate konnten zwei einzelmolekülspektroskopiebasierte Detektionsmethoden erarbeitet werden, welche einen sensitiven Nachweis proteolytischer Aktivität erlauben. Während sich das eine Verfahren der Detektion zeitlich korrelierter Fluoreszenzsignale bedient, nutzt das andere funktionalisierte Oberflächen zur Erkennung der Proteaseaktivität. Um Proteinsubstrate fluoreszent markieren zu können, musste eine neuartige Methode etabliert werden, welche die stöchiometrische Modifizierung von Proteinen unter Erhalt ihrer biologischen Funktion ermöglichte. Darüber hinaus gelang die Weiterentwicklung des Smart Probe-basierten Nachweisverfahrens zur sensitiven und spezifischen Diskriminierung von DNA-Punktmutationen durch den Einsatz von Oligonukleotiden, die zur Sonde bei der Anbindung an die Wildtypsequenzen in Konkurrenz stehen. Auf Grundlage der in diesen Arbeiten gesammelten Erfahrungen konnte zusätzlich eine neuartige, auf den speziellen Emissionseigenschaften des Coumarinfarbstoffs Dy-520XL beruhende DNA-Sonde konzipiert werden, welche ebenfalls eine eindeutige und einfache Diskriminierung von Punktmutationen mit hoher Sensitivität erlaubt