Mobilität von eGFP-Oligomeren in lebenden Zellkernen

Bewegungen von Partikeln in Zellkernen können durch die Viskosität, aktiven Transport oder die Anwesenheit von Hindernissen, wie zum Beispiel dem Chromatinnetzwerk, beeinflusst werden. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob die Mobilität von kleinen Proteinen einer Größe zwischen 27 und 108 kDa von der Chromatindichte beeinflusst wird. Die Diffusion von inerten fluoreszierenden Proteinen wurde in Zellkernen von lebenden Zellen mit Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) an einem zwei-Farben-Detektions-system untersucht. Zunächst werden der Neuaufbau und die Optimierung des Messsystems, sowie die Entwicklung einer neuen, patentierten Messkammer für mikroskopische Beobachtungen und Messungen (CHAMO) beschrieben. Im Anschluss werden Experimente vorgestellt, die FCS-spezifische Artefakte in lebenden Zellen untersuchen, sowie Strategien, um diese zu vermeiden. Insbesondere werden Artefakte besprochen, die aus der Auswahl der Fluorophore zur Kalibrierung des Fokusvolumens sowie aus der Temperatur und der Aufnahmebedingungen bei den Messungen der Fluoreszenzfluktuationen resultieren. Nachdem die optimalen Aufnahmebedingungen definiert wurden, zeigen die Ergebnisse der Experimente, dass die Mobilität von eGFP in Zellkernen lebender Zellen signifikant variiert, aber nicht mit der Chromatindichte korreliert. Die intranukleare diffusive Mobilität hängt stark von der Proteingröße ab: in einer Serie von eGFP-Oligomeren, die als inerte Sonde verwendet wurden, nimmt der Diffusionskoeffizient vom Monomer zum Tetramer viel stärker ab als für freie Moleküle in wässriger Lösung. Dennoch bleibt das gesamte intranukleare Chromatinnetzwerk für kleine Proteine bis zu einer Größe von dem eGFP-Tetramer frei erreichbar, ungeachtet der Chromatindichte oder der Zelllinie. Diffusionsmessungen in freier Lösung deuten auf eine stäbchenförmige Struktur für die eGFP-Oligomere. Diese Annahme beruht auf den gemessenen Diffusionskoeffizienten und theoretischen Rechnungen für die Diffusion zweier möglicher Geometriemodelle. Schließlich werden erstmalig Karten der Diffusion von Proteinen in Nuklei lebender Zellen, sowie von gesamten lebenden Zellen vorgestellt. Diese Kartierung unterstützt die Ergebnisse der Einzelpunktmessungen: die diffusive Mobilität von kleinen eGFP Proteinen zeigt starke Variationen in einem gegebenen Zellkern, jedoch ohne Korrelation zur Chromatindichte