Bispezifische Antikörper für die Krebstherapie

Bispezifische Antikörper (bsAk) eröffnen für die Immuntherapie von Krebserkrankungen neue Möglichkeiten und wurden bereits mit einer Vielzahl unterschiedlicher Kombinationen an Tumorantigenen und Effektorfunktionen ausgestattet. Die Relevanz dieser Wirkstoffklasse wurde erst kürzlich durch die Zulassung des bispezifischen Präparates Catumaxomab (Removab®) unter Beweis gestellt. Die breite Anwendung konventioneller bispezifischer Antikörper ist jedoch aus technischen Gründen begrenzt. Zu den meist zitierten Engpässen zählen aufwändige Reinigungsprozesse, geringe Ausbeuten und damit einhergehende hohe Produktionskosten, die meist murine Herkunft und das große Molekulargewicht, dass die Penetration in solide Tumoren erschwert. Um die angeführten Problemstellungen anzugehen, haben wir die Herstellung der bsAk in B-Zell Hybridomen vorgenommen, um möglichst auf einen professionellen Antikörperproduzenten zurückzugreifen. Der Grundgedanke hierbei war, den bispezifischen Antikörpern eine Struktur und ein genetisches Umfeld zu sichern, das konventionellen Antikörpern möglichst nahe kommt. Durch genetische Manipulation wurden bsAk synthetisiert, die aus einem Fab-Fragment bestehen, an den ein disulfidbrückenstabilisierter single-chain Antikörper (dsFv) fusioniert wurde und die somit ein deutlich kleineres Molekulargewicht aufweisen (80kDa bsAk gegenüber 150kDa IgG). Durch die Einführung humaner konstanter Domänen wurden Anstrengungen unternommen, die Immunogenität zu minimieren. Am Beispiel der bsAk FabHEAxdsFvOKT3.V3 und FabL1xdsFvOKT3.V3 werden in dieser Arbeit verschiedene Wege aufgezeigt, um den aktiven Antikörperlokus der anti-EpCAM bzw. anti-L1CAM produzierenden Hybridomlinien HEA125 und HuL1-9.3 neu zu gestalten. Grundlage hierfür war eine Kombination aus homologer Rekombination (HR) und ortsspezifischer Integration (SSR). Die eingefügte Transfektionskassette kodierte für einen disulfidbrückenstabilisierten anti-CD3 scFv-Antikörper (dsFvOKT3), der an die humane CH1-Domäne der schweren IgG1-Kette fusioniert wurde. Die Kassette wurde von Homologieregionen flankiert, die sich spezifisch an den endogenen Antikörperlokus der Maus anlagern und sich dabei am 5’ Ende mit der CH1 Domäne und am 3’ Ende mit der CH3 Domäne überlagern. Nach erfolgter Rekombination, wurde die Gesamtheit der murinen konstanten Domänen (CH1-CH3) durch die CH1-dsFvOKT3 Fusion ersetzt. Hieraus ergaben sich Hybridomlinien, die anstelle des konventionellen Parentalantikörpers, kleine bispezifische Antikörper sezernieren. Es konnte über Durchflusszytometrie nachgewiesen werden, dass FabHEAxdsFvOKT3.V3 und FabL1xdsFvOKT3.V3 an ihre zellulären Zielantigene EpCAM und CD3 bzw. L1CAM und CD3 binden. Beide bsAk erweisen sich in der proteinbiochemischen Analyse zudem als korrekt assembliert und rein. In weiterführenden Experimenten wird nun getestet, ob die bsAk die Fähigkeit besitzen, die T-Zell-vermittelte Tumorzelllyse in vitro einzuleiten. Dabei erfolgt die Tumor-Erkennung über das Fab-Fragment, welches sich von den Parentalantikörpern ableitet, während der dsFvOKT3-Anteil CD3+ T-Zellen aktiviert und an die Tumorzellen bindet. Sollten diese Erwartungen erfüllt werden, können beide Antikörper als Kandidaten für weiterführende präklinsche Studien verwendet werden und möglicherweise in die Entwicklung zweier neuer Krebsmedikamente einmünden. Eine weitere Anwendung findet die hier entwickelte Methode in der HybLib´ Bibliothek, die gegenwärtig in unserer Abteilung hergestellt wird. Hierbei handelt es sich um eine Hybridombibliothek komplett humaner Antikörper, welche die natürliche Antikörpermaschinerie von B-Zellen, die Signalgebung durch Oberflächenpräsentierte Antikörper (B-Zell Rezeptor) und die Affinitätsreifung durch die zelleigene somatische Hypermutation nutzt. Das Verfahren, das in dieser Dissertation zur Expression bispezifischer Antikörper in Hybridomen beschrieben wird, ist dazu konzipiert worden, diese Bibliothek zu ergänzen und ermöglicht es fortan den Wirkungsmechanismus des Antikörpers sehr leicht an die therapeutischen Anforderungen anzupassen. Die Methodik versteht sich als genomischer Schalter zwischen konventionellem und bispezifischem Format und wurde in der vorliegenden Arbeit erfolgreich in die Praxis umgesetzt. Das bispezifische Gerüst kann nun ohne großen Aufwand auf neue Spezifitäten angepasst werden