Identifizierung und Charakterisierung kleiner nicht-kodierender RNA Moleküle aus dem Zellkern muriner Embryonaler Stammzellen und Embryonic Bodies

In den vergangenen Jahren hat sich unser Verständnis von der funktionellen Diversität der RNA erheblich vergrößert. Besonders konnte eine große Anzahl nicht-kodierender RNA (ncRNA) Moleküle identifiziert werden, die entscheidende Schritte in der zellulären Differenzierung steuern. Angesichts der komplexen Natur der neuronalen Entwicklung wächst zunehmend die Erkenntnis, dass nicht-kodierende RNA eine bedeutende und bislang noch nicht aufgeklärte Rolle in der Kontrolle der zugrunde liegenden zellulären Differenzierungsprozesse spielen könnte. Zusätzlich zu ihrer Wichtigkeit für die neuronale Entwicklung könnte nicht-kodierende RNA auch an der Ausbildung neurodegenerativer Erkrankungen beteiligt sein. Um neue nicht-kodierende RNA aufklären zu können, die an diesen Prozessen beteiligt sind, wurde ein in vitro Modell der frühen neuronalen Differenzierung verwendet und aus zwei unterschiedlichen Differenzierungsstadien kleine nukleare RNA isoliert. Ausgehend vom Embryonalen Stammzellen (ES Zellen) der Maus wurden Spheroblasten acht Tage alter Embryonic Bodies (EBs) erzeugt. Aus beiden Entwicklungsstadien, ES Zellen und EBs, wurde RNA isoliert und dazu verwendet cDNA Bibliotheken aus kleiner nuklearer RNA herzustellen. Ein Aliquot der isolierten RNA wurde mittels in vitro Capping mit einer m7G-Cap-Struktur versehen. Hierdurch konnte ein spezifisches Muster der kleinen nuklearen RNA innerhalb der beiden Differenzierungsstadien aufgedeckt werden. RNA entsprechender Größe wurde dazu verwendet um cDNA Bibliotheken der beiden Entwicklungsstadien herzustellen. Insgesamt konnten 14 neue nukleare nicht-kodierende RNA Kandidaten in den beiden cDNA Bibliotheken identifiziert werden. Vier davon entfielen auf die cDNA Bibliothek aus ES Zellen, zehn auf die der EBs. Neun der neuen ncRNA Kandidaten Genen konnte in intronischen Bereichen des Genoms lokalisiert werden, nur zwei ncRNA Kandidaten konnten exonischen Regionen zugeordnet werden. Die Expression eines ncRNA Kandidaten (2-57) konnte im Northern Blot bestätigt werden. 2-57 zeigte eine ausgeprägte Expression vor allem in EBs und AtT-20 Zellen, während er in ES Zellen nicht exprimiert war. Neben den neuen ncRNA Kandidaten wurden auch bekannte ncRNAs, die in den cDNA Bibliotheken nachgewiesen werden konnten, auf ihre Expression untersucht. Pre-mi-690 und Y3 scRNA zeigten hierbei eine geregelte Expression in den beiden untersuchten Dif-ferenzierungsstadien. Beide waren in EBs schwächer exprimiert, als in ES Zellen und den untersuchte Zelllinien