Analysis of the cis-regulatory structure of developmentally regulated genes in zebrafish embryo

Während der embryonalen Entwicklung vertebrater Organismen wird die Genexpression durch cis-regulatorische Elemente streng kontrolliert. Die Interaktion dieser Elemente, gefolgt von der Rekrutierung der RNA Polymerase II Maschinerie, führt zur Initiation der Transkription, einer der bedeutendsten Schritte in der Regulation der Genexpression. Seit der Fertigstellung mehrer Säuger- und vertebrater Genome ist phylogenetic footprinting einer der am Häufigsten angewandten Methoden um cis-regulatorische Sequenzelemente zu identifizieren. Dadurch konnte gezeigt werden, dass nicht-kodierende Sequenzelemente, teilweise mit extremer Konserviertheit, Enhancer Funktionen besitzen können. In der hier vorgestellten Arbeit zeige ich die Identifizierung von konservierten nicht-kodierenden Elementen und die Untersuchung ihrer Funktionalität als Enhancer in vivo in transient transgenen Zebrafischembryonen am Beispiel des pax2 Locus. Konservierte nicht-kodierende Sequenzen die als Enhancer fungieren, zeigen ein signifikant erhöhtes Vorkommen in der Nähe von entwicklungsspezifischen Regulatoren und Transkriptionsfaktoren. Im zweiten Teil meiner Arbeit stelle ich eine Methode vor, die eine Kombination aus globalem- und lokalem Alignment darstellt und zur Identifizierung einer größeren Anzahl konservierter nicht-kodierender Sequenzelemente mit Enhancer-Funktion führt als bisherig verwendete Methoden. Die Mehrzahl der identifizierten Elemente wurde während der Evolution durcheinander gemischt („shuffled“). Obwohl die Mehrzahl dieser shuffled-konservierten Elemente auch hier der Ontologieklasse von Transkriptionsfaktoren und Entwicklungsregulatoren zugewiesen werden konnte, wurde jedoch auch ein erhöhtes Vorkommen in anderen Ontologieklassen festgestellt, die Gene beinhalten, die für extrazellulare Regionen und Verhalten kodieren. Eines der Hauptprobleme, das sich nach der Identifizierung neuer Enhancer stellt, ist die Zuweisung von Genen, deren Expression durch den jeweiligen Enhancer beeinflusst werden, da diese durch große Sequenzbereiche voneinander getrennt sein können. Neuere Studien zeigen außerdem, dass die Diversität von Promotoren viel größer ist als ursprünglich angenommen. Da die Interaktion von Promotoren mit Enhancern durch Multiproteinkomplexe vermittelt wird, sollte die Zusammensetzung dieser Komplexe von der Eigenschaft des jeweiligen cis-regulatorischen Elements abhängig sein. Um zu ermitteln, ob die Sequenz des Kernpromoters und Enhancer die Spezifikation der Interaktion bestimmen, wurde ein high throughput screen durchgeführt, in dem 20 Kernpromotoren und 13 Enhancer zum Einsatz kamen, um 160 verschiedene Promoter/Enhancer Kombinationen zu generieren. Die Datenanalyse nach der automatisierten Bildgebung zeigte, dass die Enhancer-Funktion eindeutig promoterspezifisch ist und dass Promotoren die sich durch eine gute EST-Abdeckung auszeichnen signifikant aktiver sind und eine höhere Anzahl an Interaktionspartnern aufweisen