Evaluation of cytokine-transducing parvoviralvectors for glioma therapy

Maligne Gliome sind die am häufigsten bei Erwachsenen auftretenden Hirntumor. Trotz großer Fortschritte in der konventionellen Behandlung, die aus Neurochirurgie, gefolgt von Strahlen- und Chemotherapie besteht, haben maligne Gliome eine sehr schlechte Prognose. Daher bedarf es dringend einer Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze. Die virale Gentherapie stellt eine interessante Alternative oder auch Adjuvans zur konventionellen Krebstherapie dar. Die autonomen Nagetierparvoviren sind aufgrund ihrer onkotropischen und onkolytischen Eigenschaften, sowie ihrer niedrigen Pathogenität besonders attraktive Kandidaten für die Entwicklung viraler Vektoren für die Gentherapie gegen Krebs. Gliome sind hochvaskularisierte Tumore, die ein stark immunsuppressives Milieu erzeugen. Daher wurde in unserem Labor vor kurzem die antitumoralen Effekte parvoviraler Vektoren, die das humane Interferon-γ-induzierte Protein-10(hIP-10)und den murinen Tumornekrosefaktor-α (mTNF-α) transduzieren, in einem syngenen, murinen Gliom-Modell untersucht. IP-10 und TNF-α sind Zytokine, die für ihre immunostimulatorischen und antiangiogenischen Eigenschaften bekannt sind. Diese rekombinanten Viren konnten das Wachstum von murinen GL261-Gliomzellen, die subkutan in immunkompetente Mäuse appliziert wurden, signifikant hemmen. Die Koinfektion der Gliomzellen mit beiden Vektoren führte zu einer kompletten Tumorregression, was auf einen synergistischen antitumoralen Effekt schließen lässt (Enderlin et al., 2008). In der vorliegenden Arbeit wurden die Mechanismen, die zu einer Hemmung des Tumorwachstums durch TNF-α- und IP-10-kodierende parvovirale Vektoren führten, untersucht. Parvoviral transduziertes TNF-α verstärkte die mRNA-Expression und Proteinsekretion von endogenem IP-10 in GL261-Zellen in vitro. Die Kombination von beiden Viren könnte auf diese Weise in IP-10-Mengen resultieren, die oberhalb eines kritischen Schwellenwertes liegen und so zu den in vivo beobachteten synergistischen antitumoralen Effekten führen. Die Analyse der zellulären Immunantwort nach peritumoraler Applikation der rekombinanten Parvoviren in etablierte, subkutane GL261 Tumore zeigte eine verringerte Tumorinfiltration von CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten im Vergleich zu PBS behandelten Tumoren. Auffallend war die drastisch verringerte Tumorinfiltration von CD4+ T-Lymphozyten durch die Behandlung mit den Zytokin-kodierenden Vektoren, die mit dem Tumorwachstum in vivo umgekehrt korrelierte. Wir vermuten, dass die antitumoralen Effekte auf einer Verringerung der CD4+ regulatorischen T-Zellen beruhen, welche eine Suppression von Immunantworten verursachen. Zudem konnten wir zeigen, dass die in vitro Infektion von GL261-Zellen mit Zytokin-kodierenden Vektoren zu einer Verringerung an TGF-β führte, welche stark mit der Infiltration von CD4+ T-Lymphozyten korrelierte. Desweiteren wurden die antitumoralen Effekte der mTNF-α- und hIP-10-transduzierenden parvoviralen Vektoren auf GL261-Zellen untersucht, die intrakranial in syngene C57BL/6 Mäuse implantiert wurden. Hierzu wurden das Tumorwachstum der mit parvoviralen Vektoren präinfizierten GL261-Zellen sowie die Überlebensrate der behandelten Mäuse beobachtet. Wildtyp Parvovirus und der virale Vektor ohne Transgen zeigten nur einen schwachen antitumoralen Effekt. Dies gleicht den Resultaten aus dem subkutanen Tumorversuch. Im Gegensatz hierzu, konnte TNF-α-, jedoch nicht IP-10-kodierende parvovirale Vektoren im intrakranial Tierversuch zu einer signifikanten Verzögerung des Tumorwachstums der GL261 Gliome sowie zu einem verlängerten Überleben der tumortragenden Mäuse führen. Zudem wurde kein synergistischer Effekt zwischen TNF-α und IP-10 beobachtet. Immunohistochemische Untersuchungen der Hirntumorproben zeigten, dass die parvovirale Infektion zu einer mäßigen Infiltration von CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten führte. Der TNF-α-transduzierende parvovirale Vektor verringerte die Vaskularisierung des Tumors und die Infiltration von CD68+ Makrophagen/Mikroglia. Dies scheint für die beobachteten antitumoralen Effekte verantwortlich zu sein. Die Monozyten chemotaktisches Proteine (MCP)-2 und -3 sind potente immunaktive Zytokine, die eine Vielzahl an Leukozyten rekrutieren. Es konnte gezeigt werden, dass MCP-3-transduzierende parvovirale Vektoren das Tumorwachstum in verschiedenen Tiermodellen hemmen. Dies veranlasste uns die Effekte von MCP-2- und MCP-3-transduzierenden vektoren im intrakranialen GL261-Gliom-Modell mit denen von TNF-α und IP-10 zu vergleichen. Es konnten jedoch keine Effekte auf Tumorwachstum und Überlebensrate beobachtet werden. Wir vermuten, dass MCP-2 und MCP-3 in den GL261-Zellen prozessiert werden, was zu ihrer Inaktivierung führt