Allosterisch regulierte Diels-Alder Ribozyme als maßgeschneiderte Werkzeuge in der Arzneistoffanalytik

Biosensoren, die auf einer katalytischen Reaktion basieren, spielen in unserem täglichen Leben eine große Rolle. Ein wichtiges Beispiel ist das Enzym Glucose-Oxidase, wel-ches in Form von Teststreifen täglich weltweit die Blutzuckerbestimmung von Millio-nen Diabetikern sehr erleichtert. In der vorliegenden Arbeit wurden die Struktur- und Funktionszusammenhänge des Phänomens Allosterie für katalytisch aktive RNA-Moleküle am Beispiel des Diels-Alder-Ribozyms untersucht. Dazu wurden molekulare Schalter (Biosensoren) auf Basis eines Diels-Alderase-Ribozyms in Kombination mit einem Theophyllin-Aptamer entwi-ckelt und charakterisiert. Diese Konstrukte sind in der Lage, die Bindung des Arznei-stoffes Theophyllin in ein katalytisches Ereignis umzuwandeln und somit ein Signal zu generieren. Dazu wurden in einem ersten Schritt acht verschiedene Klone, die aus einer vorausge-gangenen allosterischen Selektion stammten, mittels Fluoreszenz- und UV-Spektrometrie, sowie per HPLC-Chromatographie, auf deren allosterisches Verhalten gegenüber Theophyllin charakterisiert. Bei der Fluoreszenzspektrometrie wurde die Reaktion mit linker-gekoppelten Reaktanden (cis-Reaktion), bei der UV-Spektrometrie und HPLC-Chromatographie die Reaktion mit freien Reaktanden (trans-Reaktion) an-gewandt. Der am stärksten allosterisch regulierte molekulare Schalter, MH23, wies ma-ximal eine ca. 70-fache Aktivierung durch Theophyllin für die Reaktion mit linker-gekoppelten Reaktanden auf. Für die echte katalytische Reaktion mit freien Reaktanden wurde eine 3- bis zu 5-fache Aktivierung beobachtet. Im nächsten Schritt wurden zwei allosterische Selektionen auf Basis der SELEX-Technologie (Systematic Enrichment of Ligands by Exponential Enrichment) mit zwei unterschiedlich konstruierten RNA-Bibliotheken, Helix 1 und Helix 3, durchgeführt. Bei den beiden RNA-Bibliotheken handelte es sich jeweils um Diels-Alderase-Ribozyme, an denen das Theophyllin-Aptamer entweder an Helix 1 oder an Helix 3 über einen randomisierten, doppelsträngigen Abschnitt verknüpft war. Während für die RNA-Bibliothek H-I ein kontinuierlicher Anstieg an immobilisierten RNA-Spezies über insgesamt sieben Runden beobachtet werden konnte, war für die RNA-Bibliothek H-III innerhalb von sechs Runden kein Anstieg zu verzeichnen. Ein interessanter Nebenbe-fund waren drei in der Sequenz unterschiedliche Klone aus der RNA-Bibliothek H-I, die alle eine höhere katalytische Aktivität im Fluoreszenzspektrometrischen Assay als das ursprüngliche Diels-Alderase-Ribzoym zeigten. Die Aktivität der Klone war allerdings unabhängig von der Theophyllin-Konzentration. Eine detaillierte Analyse der Sequenzen aller isolierten Klone der letzten beiden Selek-tionsrunden aus beiden Bibliotheken zeigte, dass kein isolierter Klon über ein für die Bindung von Theophyllin intaktes Aptamer verfügte, was die nicht vorhandene Aktivie-rung durch Theophyllin der meisten Klone erklären könnte. Im abschließenden Projekt wurde mittels rationalen Designs und Fluoreszenzspektro-metrischen Assay allosterisch regulierte Diels-Alderase-Ribozyme entwickelt. Das am stärksten durch Theophyllin aktivierte Konstrukt zeigte in der linker-gekoppelten Reak tanden eine ca. 50-fache Aktivierung. Unter den Bedingungen echter Katalyse mitfreien Reaktanden konnte eine 9- bis 15-fache Aktivierung in Anwesenheit von Theophyllin beobachtet werden. Zusammenfassend konnte durch die vorliegende Arbeit gezeigt werden, dass es möglich ist, molekulare Schalter auf Basis des Diels-Alderase-Ribozyms zu entwickeln. Ferner wird die Vielseitigkeit des Diels-Alderase-Ribozyms und von RNA im Allgemeinen durch die Tatsache unterstrichen, dass an zwei räumlich unterschiedlichen Stellen ein Bindungsereignis in ein katalytisches Ereignis umgewandelt werden konnte. Die erhal-tenen Schaltfaktoren waren in der Reaktion mit linker-gekoppelten Reaktanden jeweils höher als für die echte katalytische Reaktion mit freien Reaktanden