SNARE-Interaktionen im frühen sekretorischen System der Pflanzenzelle

Eine essentielle Funktion aller eukaryotischen Zellen ist die Kontrolle des Transports von Prote-inen und Lipiden innerhalb des Endomembransystems. Die Fusion von Membranen ist eine fundamentale biochemische Reaktion und ein wichtiger Schritt aller vesikulären Transportvor-gänge, insbesondere des sekretorischen und des endocytotischen Wegs. Die wesentlichen Schritte des Vesikel-vermittelten Transports sind die Formation von Vesikeln des Donor-Kompartiments, die Translokation und das „Tethering“ dieser Vesikel zu einem Zielkomparti-ment und letztendlich das Andocken und die Fusion der Vesikel mit dem Zielkompartiment. Das gegenwärtige Modell der Spezifität der Vesikelfusion besagt, dass diese auf entsprechenden SNARE-Proteinen mit einer genau definierten subzellulären Lokalisation beruht (Söllner et al., 1993; Rothman and Warren, 1994). Seit der ersten Arbeit zu SNARE-Proteinen aus Säugerzel-len (Block et al., 1988) gelang es verschiedenen Arbeitsgruppen weitere strukturelle Bestandtei-le der SNARE-Komplexe in Hefe und Säugern zu identifizieren und die SNARE-vermittelte Fusion auch funktionell zu charakterisieren (Bennet and Scheller, 1993; Burri and Lithgow, 2004; Hong, 2005; Jahn and Scheller, 2006). Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die funktionelle Charakterisierung und Lokalisierung der SNARE-Proteine LeBet1, LeBos1, Le-Sec22 und LeSed5 in Nicotiana tabacum durch in vivo Experimente. Zur Charakterisierung der jeweiligen SNARE-Proteine wurde eine Methode verwendet mit der eine Veränderung der Transportvorgänge im frühen sekretorischen Weg visualisiert werden konnte. Hierbei wurde der Einfluss der verschiedenen SNARE-Proteine auf die Sekretion eines löslichen Reporterproteins (a-Amylase) in Tabak-Protoplasten untersucht und quantifiziert. Die Überproduktion der beiden SNARE-Proteine LeBet1 und LeSec22 in ihrer Wildtypform und auch als Transmembrandomäne-Deletionsmutanten zeigte keinen Einfluss auf die Sekretion von a-Amylase. Anhand von Lokalisierungsstudien konnte LeBet1 am Golgi-Apparat und Le-Sec22 sowohl am Golgi-Apparat als auch am ER lokalisiert werden. Die Überproduktion von LeBos1 zeigte einen inhibitorischen Effekt auf die a-Amylase-Sekretion, wohingegen die Transmembrandomäne-Deletionsmutante keinen Einfluss darauf hatte. Bei Koexpressionsstudien mit Fluoreszenzfusionsproteinen in Tabak-Protoplasten oder BY-2 Zellen kam es jeweils zu einer Umverteilung des Golgi-Markers ManI-RFP in das ER. Nach Behandlung mit BFA lösten sich die punktartigen Strukturen von YFP-LeBos1 auf und die Fluoreszenz konnte im ER detektiert werden; woraus hervorgeht, dass LeBos1 im Golgi-Apparat lokalsiert ist. Zur funktionellen Charakterisierung des SNARE-Proteins LeSed5 wurde dessen Einfluss auf die Sekretionsrate der a-Amylase sowohl mit den jeweiligen Wildtyp-Proteinen als auch mit den dNT-, dTMD- und dNTdTMD-Mutanten untersucht. Die Wichtigkeit der Transmembran-domäne zeigte sich durch den fehlenden inhibitorischen Effekt der dTMD- und dNTdTMD-Mutanten, wie er sonst bei der Überexpression von LeSed5-Wildtyp und dessen dNT-Mutante auftrat. LeSed5 beeinträchtigt sowohl anterograden als retrograden Transport zwischen ER und Golgi-Apparat, was nicht auch zuletzt durch den inhibitorischen Effekt auf den Reporter a-Amylase-HDEL gezeigt werden konnte. Die Daten aus den Ergebnissen ließen den Schluss zu, dass der inhibitorische Effekt zeitabhängig ist. Dabei setzte zunächst die Inhibierung der Sekre-tion sofort ein, während die Toxizität des Proteins LeSed5 an sich aber erst nach vier Stunden wirksam wurde. CLSM-Studien von LeSed5 zusammen mit Marker Proteinen, die über COPII-Vesikel transportiert werden zeigten, dass deren korrekte Lokalierung nicht mehr gewährleistet wurde und diese hauptsächlich im ER zurückblieben. Der Transport der vakuolären Proteine wurde bei Koexpression mit LeSed5 hingegen nicht beeinflusst. Der inhibitorische Effekt von LeSed5 auf den ER-Golgi-Transport wurde bei Fusion eines XFP-Proteins an den C-terminus des SNAREs aufgehoben, während er bei der Fusion an den N-Terminus erhalten blieb. Das nicht funktionelle C-terminale und auch das funktionelle N-terminale Fusionsprotein konnten am Golgi-Apparat lokalsiert werden, was auch durch BFA-Studien belegt wurde. Die Expressi-on des funktionellen Fusionsproteins führte zu einer vermehrten Aggregatbildung; diese Aggre-gate erwiesen sich als BFA-resistent. Was diese Aggregate im Endeffekt wirklich darstellen konnte durch die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Floreszenzstudien nicht beantwortet werden. Die Ergebnisse der Arbeit weisen jedoch darauf hin, dass das SNARE-Protein LeSed5 einen wichtigen regulatorischen Faktor in der Fusionsmaschinerie des ER-Golgi-Transports darstellt