Identification and Characterization of interacting partners of cytoplasmic domain of Xenopus Paraxial Protocadherin

Die Gastrulation ist einer der entscheidenden Schritte der Embryogenese. Eine wachsende Anzahl von Proteinen, die zur Regulation der Gastrulation beitragen ist in den letzen Jahren identifiziert worden. Eines dieser Proteine ist das Xenopus Paraxiale Protocadherin (xPAPC). xPAPC kann die C-Cadherin-vermittelte Zelladhäsion modulieren und ist an der Trennung von Zellpopulationen beteiligt. xPAPC besitzt zusätzlich Signalfunktionen, welche für die Regulation von convergenten Extensionbewegungen (CE) und der Gewebstrennung während der Gastrulation notwendig sind. xPAPC beeinflusst die GTPase Rho und die C-jun terminale Kinase (JNK), welche Effektoren des planaren Polaritäts (PCP) Signalwegs sind. Die zytoplasmatische Domäne von xPAPC (xPAPCc) ist für diese Signalfunktion unabdingbar. Dennoch sind bisher keine Proteine identifiziert worden, die mit xPAPCc interagieren und die Signale intrazellulär vermitteln. Im Rahmen dieser Arbeit wurden 3 Strategien zur Identifizierung und Charakterisierung von Proteinen, die mit xPAPCc interagieren angewandt mit dem Ziel, den Mechanismus der xPAPC-vermittelten Signalkette aufzuklären. Während ein „Kandidatansatz“ und eine GST-pull-down Strategie keine befriedigenden Ergebnisse lieferten, wurden einige potentielle Interaktionpartner durch einen Yeast-Two- Hybrid Ansatz identifiziert. Zwei dieser Proteine, Sprouty1(Spry1) und Casein Kinase 2(CK2) wurden funktionell charakterisiert. Die physikalische Interaktion von xPAPCc mit diesen Proteinen wurde durch Co- Immunopäzipitations Experiment bestätigt. Die Interaktion von xPAPCc und Spry1 ist nicht von einer konservierten Region von 16 Aminosäuren abhängig, welche in allen 4 PAPC Homologen der Wirbeltiere vorhanden ist, sondern von der Phosphorylierung der Serine 741 und 955. xPAPC antagonisiert funktionell Spry1 im Kontext von CE Bewegungen und bei der Gewebstrennung. Spry1 inhibiert die Membranrekrutierung der PCP Komponenten Protein Kinase delta (PKCdelta) und Dishevelled (dsh). Koexpression von xPAPC kann die durch Spry 1 inhibierte Membranlokalisierung von PKCdelta und dsh retten. Die Interaktion von xPAPC und Spry1 ist für die Fähigkeit von xPAPC Spry1 zu antagonisieren essentiell. XPAPC Protein in dem S741 und S955 Reste mutiert sind kann nicht mehr an Spry1 binden und es nicht mehr antagonisieren. Diese Arbeit zeigt klar, dass die Interaktion von xPAPC und Spry1 für die Modulation des PCP Signalwegs ist. xPAPC vermittelte Signale stimulieren CE Bewegungen und Gewebstrennung. Durch diese Ergebnisse ist es erstmals möglich eine Verbindung zwischen Protocadherinen und nicht-canonischen Wnt-Signalwegen in Wirbeltieren herzustellen. Diese Arbeit zeigt auch, dass xPAPC den Wnt/-Catenin Signalweg modulieren kann. CK2 stimuliert den Wnt/-Catenin Signalweg durch die Stabilisierung von -Catenin. xPAPC antagonisiert CK2im Xenopus Achseninduktionstest und hemmt die Expression von des Wnt Ziegens xnr-3 in animalen Kappen Explantaten. Zusammenfassend kann xPAPC als „Schalter“zwischen canonischem und nicht-canonischem Wnt Signalweg angesehen werden. Durch die Bindung von Spry und CK2 kann xPAPC nicht-canonische Wnt Signale verstärken und so die Gastrulationsbewegungen modulieren. Gleichzeitig wird der canonische Wnt- Signalweg gehemmt, was einen Einfluss auf die Spezifizierung des Mesoderms hat