Untersuchung zur Expression, Spezifität und Regulation der Guaninnukleotid-Austauschfaktoren RhoGEF10 und RhoGEF17

Die koordinierte Regulation von Rho-GTPasen ist entscheidend für die Funktion von vaskulärem Gewebe. Rho-GTPasen kontrollieren hierbei als zentrale Mediatoren Prozesse wie Proliferation, Migration und Kontraktion sowohl glattmuskulärer als auch endothelialer Zellen. Bis heute ist jedoch nur wenig über die unmittelbar beteiligten akzessorischen Proteine und Signalübertragungswege bekannt. Das Ziel dieser Arbeit war es, in diesem Kontext die Rolle der Guaninnukleotid-Austauschfaktoren RhoGEF10 und RhoGEF17 zu charakterisieren sowie deren übergeordnete Regulation näher zu untersuchen. Dazu wurden unterschiedliche zelluläre Systeme (permanente Zelllinien (HEK-293 und TSA), isolierte glattmuskuläre Zellen der Rattenaorta (RASMC) und humane Endothelzellen der Umbilikalvene) als Modell verwendet und die Signalübertragung mittels diverser molekularer Werkzeuge (Toxine, bioaktive Substanzen, eukaryote Expressionsvektoren, rekombinante Adenoviren, shRNA-kodierende Adenoviren) beeinflusst. Im ersten Teil dieser Arbeit wird gezeigt, dass RhoGEF10 spezifisch RhoA-C mit einer Präferenz für RhoB aktiviert. Des Weiteren haben immunhistologische Untersuchungen eine vorwiegende Expression von RhoGEF10 im Gefäßendothel ergeben. Der zweite Teil dieser Arbeit zeigt, dass das im Gefäßendothel, vor allem aber in der glatten Muskulatur der Gefäße, exprimierte, RhoA-C spezifische RhoGEF17 durch die cGMP-abhängige Proteinkinase I-α (cGKI- α) spezifisch aktiviert wird. Diese Aktivierung setzt eine direkte Interaktion beider Proteine voraus und beinhaltet eine koordinierte Phosphorylierung von RhoGEF17 sowie möglicherweise von RhoA. Mittels der gezielten Mutagenese und der Generierung von trunkierten Mutanten von RhoGEF17 konnte nachgewiesen werden, dass zwei cGK-spezifische Phosphorylierungsstellen (Serine 43 und 1331) für die Regulation der RhoGEF17-Aktivität entscheidend sind. Darüber hinaus wurde ein positiver Rückkopplungsmechanismus innerhalb des cGKI-α/RhoGEF17/RhoASignalwegs identifiziert, welcher in Abhängigkeit der RhoA-regulierten Kinase ROCK und von Phospho-Serin/Threonin-spezifischen Phosphatasen erfolgt. Zusätzlich zu diesen mechanistischen Untersuchungen ist es gelungen in RASMC durch shRNA-mediierte Depletion von endogenem RhoGEF17 zu zeigen, dass die cGMP-abhängige RhoA-Aktivierung in diesen Zellen tatsächlich von der RhoGEF17-Expression abhängig ist. Da die Fehlregulation der Proliferation, Migration und Kontraktion von vaskulären Zellen z. B. bei der Arteriosklerose und der Hypertonie eine wichtige Rolle spielt, könnten RhoGEF17 und RhoGEF10 somit bei diesen Erkrankungen von pathophysiologischer Bedeutung sein