Integration von Rezeptoren in inerte Matrices zur markierungsfreien und quantitativen Detektion biospezifischer Wechselwirkungen mit LSPR-aktiven Nanopartikeloberflächen

Die vorliegende Arbeit beschreibt die Präparation und den Einsatz optisch aktiver Nanopartikeloberflächen in der Immundiagnostik. Diese Sensoroberflächen bestehen aus oberflächen-adsorbierten Core-shell Partikeln (Nanopartikel mit einem dielektrischen Kern und einer metallischen Hülle) und zeigen ausgeprägte Resonanzen im sichtbaren Spektralbereich, die auf eine Anregung von sowohl lokalisierten als auch propagierenden Oberflächenplasmonenresonanzen zurückgeführt werden können. Da die Resonanzlage empfindlich gegenüber Änderungen des umgebenden Brechungsindex reagiert, kann sie zu einer markierungsfreien Detektion und Quantifizierung von Bindungsereignissen eingesetzt werden. Durch die kombinierte Anregung von lokalisierten und propagierenden Plasmaschwingungen resultieren im Vergleich zur konventionellen SPR sowohl höhere optische Extinktionswerte (Steigerung um etwa 3 Größenordnungen), die ein verbessertes Signal/Rausch-Verhältnis zur Folge haben, als auch eine höhere Sensitivität gegenüber Änderungen der dielektrischen Eigenschaften ihrer unmittelbaren Umgebung; bezüglich der Adsorption von Oktadekanthiol konnte eine etwa 5-fache Sensitivitätssteigerung erzielt werden. Zudem bietet das Dicken¬verhältnis von Kern/Schale einen weiteren Parameter, durch den die Resonanzlage über den gesamten sichtbaren Bereich verschoben und somit gezielt außerhalb des Absorptionsfensters von Störkomponenten platziert werden kann. Anhand geeigneter Kalibrationsmessungen und Bindungsstudien wurde gezeigt, dass analog zur konventionellen SPR in dem analysierten Bereich von Massenbelegungen bis hin zu 600 ng/cm2 und einer lateral gemittelten Schichtdicke von 75 Å (lokale Maximalwerte ~ 24 nm) keine Minderung der Sensorantwort eintritt und eine lineare Beziehung zur Resonanzverschiebung besteht. In verschiedenen immunodiagnostischen Anwendungen (Antikörper-Antigen-, Peptid-Antikörper-Assays) konnten die Bindungsereignisse daher nicht nur detektiert, sondern mittels der zuvor bestimmten Eichwertfaktoren auch quantifiziert werden, wobei eine gute Übereinstimmung zu den anhand anderer Analysemethoden (XPS, ELISA) erhaltenen Massenbelegungen und Schichtdicken erhalten wurde. Im Vergleich zur konventionellen SPR besitzen diese Systeme weitere Vorteile, die vor allem einen Einsatz im Mikroarray-Format betreffen. Die Möglichkeit zu einer sehr viel höheren lateralen Auflösung (theoretisch im Nanometerbereich) sowie die technisch einfache Art der markierungsfreien Detektion sprechen für einen direkten Einsatz in hoch parallelisierten und miniaturisierten Biochips (DNA-, Peptid- und Protein-Arrays), in denen eine Vielzahl an Bin¬dungsereignissen ortsaufgelöst und simultan (bei Einsatz einer CCD-Kamera) bestimmt werden können. Zur Demonstration einer solchen Applikation wurden photochemisch strukturierte Oberflächenbeschichtungen erzeugt und mittels LSPR-Imaging ausgelesen; diese wurden anschließend fluoreszenzspektroskopisch visualisiert, wobei eine gute Übereinstimmung bezüglich Geometrie und Ausmaße der erzeugten Strukturen erhalten wurde. Eine eindeutige Detektion und Quantifizierung biomolekularer Wechselwirkungen setzt jedoch die Spezifität der beobachteten Bindungsereignisse voraus. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit betraf daher die Erzeugung von Oberflächenbeschichtungen auf Polyethylenglykolbasis, die geeignete Funktionalitäten zu einer Integration von Rezeptoren für immunodiagnostische Anwendungen aufweisen, eine unspezifische Adsorption jedoch weitgehend unterdrücken. Hierzu wurden endgruppenfunktionalisierte (OH, COOH, NH2) Polyethylenglykolthiole unterschiedlicher Kettenlängen (15 – 40 EG-Einheiten) synthetisiert und nach der Adsorption auf Au-bedampften Si-Wafern hinsichtlich ihrer Bindungskapazität und Proteinresistenz untersucht. Unabhängig von der Art der Terminierung ergab sich eine deutliche Abhängigkeit der Resistenz von der Kettenlänge, wobei mit zunehmender EG-Anzahl ein Anstieg der Proteinresistenz beobachtet wurde. Aber auch die Endgruppe zeigte einen entscheidenden Einfluss auf die Adsorptionsrate; bezüglich der funktionellen Terminierung konnte folgende Resistenzreihe aufgestellt werden: NH2 < COOH << OH. Unabhängig von der Kettenlänge erfordert vollständige Proteinresistenz eine elektrostatische Neutralität der erzeugten Beschichtung. Im Fall durch Protolyse geladener Oberflächenfunktionalitäten resultieren höhere Adsorptionsraten bei positiver Ladung (protonierte Aminogruppen), die auf verstärkte Wechselwirkungen mit den üblicherweise negativ geladenen Proteinen zurückgeführt werden können. Weiterhin zeigte sich, dass eine Zunahme der Proteinresistenz mit einer abnehmenden Antikörper-Bindungsrate verbunden ist. In immunodiagnostischen Anwendungen muss daher über die Parameter der Endgruppenfunktionalität und Kettenlänge ein geeigneter Kompromiss zwischen Proteinresistenz und Rezeptor-Dichte eingestellt werden