Proteomanalyse neuronaler Stammzellen

In bestimmten Regionen des Gehirns von Säugetieren und somit auch des Menschen entstehen zeitlebens neue Zellen, die sich zu Nervenzellen und Gliazellen entwickeln. Die neu entstandenen Zellen scheinen sich entsprechend ihrer physiologischen Funktion in das Gewebe zu integrieren und elektrisch aktiv zu sein. Die Ursprungszellen werden als neuronale Stammzellen bezeichnet; sie können ihre Stammzelleigenschaften über die gesamte Lebensspanne des Organismus beibehalten. Zu diesen Eigenschaften gehören Teilungsfähigkeit, Selbsterneuerung und die Fähigkeit, sich zu Gehirnzellen zu differenzieren. Die Signalwege, die zur Aufrechterhaltung der Stammzelleigenschaften aktiviert werden, sind bislang unbekannt. Wir haben die Proteomanalyse basierend auf der zweidimensionalen Gelelektrophorese in Kombination mit der Massenspektrometrie dazu eingesetzt, zum einen das Proteom neuronaler Stammzellen zu erfassen (Proteomprofilierung) und zum anderen die Veränderungen des Proteoms unter Differenzierungsvorgängen zu untersuchen (funktionelle Proteomanalyse). Dazu haben wir neuronale Stammzellen aus drei Regionen des Gehirns ausgewachsener Ratten isoliert, in denen spontane Neurogenese beschrieben wurde, nämlich dem Hippokampus, der Subventrikulärzone -einer Wachstumszone entlang der Seitenventrikel- und dem Bulbus olfaktorius. Die Stammzellen haben wir über sechs Wochen in Kultur vermehrt und Proteinlysate angefertigt. Um das Proteom der in vitro differenzierten Zellen mit demjenigen undifferenzierter Zellen vergleichen zu können, haben wir ein Protokoll zur in vitro Differenzierung der neuronalen Stammzellen entwickelt. Im Rahmen der Proteinprofilierung konnten wir in undifferenzierten neuronalen Stammzellen etwa 2500 Proteinspots anfärben. Nicht jeder dieser Spots entspricht einem einzelnen Protein; durch das Vorhandensein von Proteinisoformen und posttranslationalen Modifikationen ist die Zahl der Proteine geringer. Im Rahmen der funktionellen Proteomanalyse haben wir die Veränderungen der Proteinzusammensetzung der Stammzellen während der Differenzierungsvorgänge der Stammzellen gemessen. Die Stammzellen durchlaufen hierbei eine Reihe tiefgreifender morphologischer und funktioneller Veränderungen, die sich auch in der Veränderung der Proteinzusammensetzung widerspiegeln. Wir fanden nach Differenzierung mehr als 350 Proteinspots mit veränderter Proteinkonzentration, die wir zahlreichen regulierten Signal- und Stoffwechselwegen zuordnen konnten. Die grössten Veränderungen waren im Zytoskelet und dem zellulären Stoffwechsel nachzuweisen, aber auch in transkriptionsregulierenden Proteinen und Protein-Faltungshilfen, den sogenannten molekularen Chaperonen. Aufgrund der Proteomanalysen erhielten wir Hinweise, dass der Wnt-Signalweg ein Signalweg ist, der die Eigenschaften neuronaler Stammzellen aufrechterhält. Der Wnt-Signalweg wurde bisher in anderen Zellen als einer der verantwortlichen Signalwege bei der Regulation von Zellwachstum und -größe, der Zellorientierung im Raum und der Transkriptionskontrolle beschrieben. Durch ergänzende biochemische Verfahren wie z. B. Western Blot, Immunzytochemie und Polymerase-Kettenreaktion und Gabe des Inhibitors Genistein konnten wir nachweisen, dass die Aktivierung dieses Signalwegs wesentlich für die Differenzierung neuronaler Stammzellen in Nervenzellen und Gliazellen ist und gleichzeitig die Selbsterneuerung und Teilungsfähigkeit neuronaler Stammzellen unterbrechen kann. Zusammenfassend konnten wir mit Hilfe der zweidimensionalen Gel-Elektrophorese in Kombination mit der Massenspektrometrie durch Proteomprofilierung ein Proteininventar von etwa 2500 Proteinen adulter neuronaler Stammzellen erstellen, die aus den neurogenen Zonen des Rattenhirns isoliert wurden, nämlich aus Hippokampus, Subventrikulärzone und Bulbus olfaktorius. Die so entstandene Proteomdatenbank haben wir über das Internet zugänglich gemacht und damit den Grundstein für weitere Vergleiche des Proteoms neuronaler Stammzellen mit dem anderer (Stamm-) Zelltypen eröffnet. Gleichzeitig konnten wir statistische und grafische Werkzeuge bereitstellen, die zu einer weiteren Standardisierung der Proteomanalyse beitragen