Identifizierung und Charakterisierung viraler und zellulärer Komponenten, die an den frühen Schritten der HBV-Infektion beteiligt sind

Das humane Hepatitis B Virus (HBV) zeichnet sich durch eine enge Wirtsspezifität und einen ausgeprägten Lebertropismus aus. Diese Eigenschaften werden überwiegend von den frühen Schritten der Infektion bestimmt. So produzieren Maushepatozyten mit stabil integriertem HBV-Genom zwar infektiöse Viren, können selber aber nicht infiziert werden. Das Fehlen eines infizierbaren Zellkultursystems war lange Zeit limitierend für die Erforschung der frühen Infektionsschritte. Die zellulären Rezeptoren, die an der HBV-Aufnahme oder der Membranfusion beteiligt sind, konnten bislang noch nicht identifiziert werden. Erst die Entdeckung, dass die differenzierbare Hepatomzelllinie HepaRG mit HBV infiziert werden kann (Gripon et al., 2002), ermöglicht es, den Aufnahmemechanismus von HBV zu untersuchen. In Infektionskompetitionsversuchen können nun virale und zelluläre Proteine auf ihre Beteiligung an den frühen Schritten der Infektion getestet werden. In Experimenten mit rekombinant hergestellten HBV-Partikeln zeigten Le Seyec et al., dass Deletionen von 5 Aminosäuren innerhalb der ersten 77 Aminosäuren der preS1-Domäne des L-Oberflächenproteins zum Verlust der Infektiosität führten. Durch Infektions-kompetitionsversuche konnte ein inhibitorisch aktives, synthetisches Peptid identifiziert werden, das nur die Aminosäuren 2 bis 48 umfasst und an Glycin-2 myristoyliert ist (Gripon et al., 2005). Neben der Etablierung von biochemischen Methoden zur Identifizierung des zellulären HBV-Rezeptors, war es das Ziel dieser Arbeit, diejenigen Aminosäuren zu bestimmen, die für die inhibitorische Aktivität des HBVpreS/2-48myr-Peptids verantwortlich sind. Hierfür wurde ein E. coli-Expressionsystem etabliert, das die Herstellung von rekombinanten HBVpreS-GST-Fusionsproteinen mit Deletions- und Punktmutationen erlaubt. Durch die Coexpression der Hefe-N-Myristoyltransferase (NMT) konnte eine in vivo Myristoylierung der Fusionsproteine erreicht werden. Das HBVpreS-GST-Fusionsprotein inhibierte die Infektion bei nanomolaren Konzentrationen. Es besitzt daher eine vergleichbare Aktivität wie das synthetische HBVpreS/2-48myr-Peptid. Die Bestimmung der HBV-Infektionsinhibitionsaktivität von verschiedenen preS-Fusionsproteinmutanten zeigte, dass Deletionen innerhalb der Aminosäuren 21 bis 48 zwar Einfluss auf die Aktivität des Peptids haben, aber nicht zu einer vollständigen Inaktivierung führen. Deletionen innerhalb der Aminosäuren 11 bis 21 dagegen führten zum vollständigen Verlust der Inhibitionsaktivität. Innerhalb dieses Bereichs konnten drei hochkonservierte Aminosäuren identifiziert werden (Aminosäuren 11, 12 und 13), die für die Inhibitionsaktivität von HBVpreS/2-48myr unersetzlich sind. Der Austausch nur einer dieser Aminosäuren führte zum vollständigen Verlust der Inhibitionsaktivität. Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine Resistenzentwicklung gegen das antivirale HBVpreS/2-48myr-Peptid über die Variation dieser essentiellen Aminosäuren unwahrscheinlich ist und dass das Peptid einen sensiblen frühen Schritt des viralen Lebenszyklus hemmt. Acylierte preS1-Peptide stellen somit eine neue, rekombinant herstellbare Klasse von HBV-Aufnahmeinhibitoren dar, die in der Behandlung einer akuten und möglicherweise auch einer chronischen Hepatitis B zum Einsatz kommen könnten