In vitro Selektion von Ribozymen für eine 1,3-dipolare Cycloaddition

Ribonukleinsäuren sind Moleküle, die ein derart breites Reaktionsspektrum besitzen, dass man die Existenz einer früheren „RNA Welt“ annehmen kann, in der alle biologischen Prozesse unter Beteiligung diesen Biomolekülen abgelaufen sind. Wichtige experimentell bewiesene Fähigkeiten von RNA beinhalten die Bindung einer Vielzahl von unterschiedlichen Substraten, ihren ribosomal katalytischen Beitrag zur Proteinsynthese in vivo und natürlich auch ihre Katalysefähigkeit bei chemischen Umsetzungen in vitro. Die Anwendung der letzten Eigenschaft resultiert in der Wirkstoffforschung und der Diagnostik in der Entwicklung von maßgeschneiderten RNA-basierten Enzymen (Ribozyme), die durch entsprechende Techniken erhalten werden können. Einen Beitrag zur Erweiterung dieser Techniken leistet diese Arbeit. Sie beschreibt den Aufbau, die Etablierung und die Analyse einer neuen Variante eines Selektionssystems zur Generierung von Ribozymen unter Verwendung von kurzlebigen, hoch reaktiven in situ generierten Substraten. Für die Etablierung der Methode wurde als Zielreaktion eine in der organischen Chemie zum Aufbau von Heterocyclen essentielle Reaktion gewählt - die 1,3-dipolare Cycloaddition. Kombinatorische RNA-Bibliotheken wurden nach aktiven Molekülen durchsucht, die eine Reaktion zwischen einem Acrylat- funktionalisierten RNA-Konjugat und einem biotinylierten Nitriloxid katalysierten. Dabei wurde die Methode der direkten Selektion mit spaltbaren linkergekoppelten Reaktanden verwendet. Der dipolare Acrylat-Reaktant wurde über einen flexiblen Dinukleotidlinker an die RNA durch enzymatische Ligation gekoppelt. Eine innerhalb diese Linkers positionierte photospaltbare o-Nitrophenylgruppe sollte zum einen die Regioselektivität der Selektionsreaktion gewährleisten, zum anderen sollte sie möglichen Nebenreaktionen verhindern. Nach der Reaktion konnten aktive RNA-Moleküle von nicht umgesetzten Sequenzen durch Biotin-Streptavidin-Wechelwirkung isoliert werden. Durch Amplifikation der angereicherten Sequenzen und deren erneute Umsetzung wurden bis zu 15 Selektionszyklen durchgeführt. Die Spezifität der zu katalysierenden Reaktion konnte am Reaktionsort des Linkers gezeigt werden und auf der Ebene des RNA-Pools indirekt durch Retardation des Produktes auf Polyacrylamidgelen demonstriert werden. Es wurden drei Selektionen durchgeführt. Die erste Selektion lieferte wichtige Ergebnisse für die Optimierung des Selektionsprozesses. In weiteren Selektionen wurden zum einen in einem Selektionspfad auf alle direkt durch Immobilisierung selektierten Sequenzen fokussiert, während in einem hoch stringenten Selektionspfad auch die Laserspaltung als zweites Selektionskriterium beachtet wurde. Die Anreicherung potenzieller Katalysatoren konnte gelegentlich beobachtet werden, jedoch wurde keine Anreicherung im ausreichenden Maße festgestellt. Deutliche Anzeichen einer erhöhten Aktivität konnten nicht reproduziert werden. Anstatt die selektierten Bibliotheken nach 15 Runden zu klonieren und zu sequenzieren, wurden die Selektionsbedingungen weiter analysiert, um die experimentellen Beobachtungen zu erklären. Diese Untersuchungen deuteten auf eine erhöhte Reaktivität der kurzlebigen Substrate gegenüber RNA-internen Positionen hin. Möglicherweise sind Selbstmodifizierungsreaktionen eine Erklärung für die Anreicherung während der ersten Selektion mit in situ aktivierten Reaktanden; entsprechende Experimente bekräftigen diese Annahme. Die Ergebnisse aus den Selektionsexperimenten und die nachfolgende Analyse beinhalten wertvolle Hinweise für ein zukünftiges Design von Selektionssystemen, die das Ziel verfolgen, ökologische Katalysatoren aus RNA für komplexe chemische Umsetzungen zu generieren