Neue DNA-Biosensoren mit direkter elektrochemischer Detektion auf Basis von Metall-PNA-Konjugaten

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wird die Entwicklung neuartiger Biosensoren für die DNA-Analytik auf der Basis von Konjugaten aus Peptid-Nukleinsäure(PNA) mit kovalent gebundenen Metallocenen (Ferrocen und Cobaltocenium) beschrieben. Kommerziell erhältliche DNA-Arrays sind hinsichtlich der Erkennung von Punktmutationen in den Targets limitiert, da DNA-Oligomere als Sonden über keine ausreichend hohe Spezifität verfügen. PNA-Oligomere hingegen hybridisieren mit komplementären DNA-Sequenzen via Watson-Crick-Basenpaarung, jedoch zeigen die Duplizes eine erhöhte Schmelztemperatur und zugleich eine gesteigerte Empfindlichkeit gegenüber Fehlstellen im Vergleich zu DNA•DNA-Hybriden. Die kovalent an die PNA gebundenen Metallocene gestatten eine elektrochemische Detektion der erfolgten Hybridisierung mittels Square-Wave-Voltammetrie (SWV) und Cyclovoltammetrie (CV). Es wurden neuartige Konjugate aus elektrochemisch aktiven Metallverbindungen und Peptidnukleinsäuren (PNA) synthetisiert und charakterisiert. Ferner wurde das Hybridisierungsverhalten mit voll-komplementärer sowie mit Fehlstellen-haltiger DNA mittels UV-Schmelzexperimenten untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass eine intern gelegene Fehlstelle einen weitaus größeren Destabilisierungseffekt mit sich bringt als eine terminal liegende. Ferner wurde anhand dieser Experimente das Hybridisierungsverhalten auf Oberflächen immobilisierter Hybride im Vorfeld geprüft und die Temperaturbedingungen für die elektrochemischen Messungen optimiert. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurden die PNA-Metall-Oligomere als Einzelstränge sowie als PNA•DNA-Hybride via SH-Gruppen auf die Oberfläche eigens präparierter Gold-Mikroelektroden aufgebracht. Die Oberfläche und Zusammensetzung dieser so genannten „self-assembled monolayers“ (SAMs) wurde mit Hilfe der Ellipsometrie und der Röntgen-Photo-Elektronenspektroskopie charakterisiert. Die immobilisierten Metall-PNA-Einzelstränge wurden mit voll-komplementärer und Fehlstellen-haltiger DNA zusammengebracht und die Hybridisierung mit SWV sowie mit elektrochemischer Impedanzspektroskopie (EIS) verfolgt. Im Sinne einer Array-Technik konnte mit Metall-PNA als Sonde auf elektrochemischem Wege zwischen voll-komplementärem und Fehlstellen-haltigem DNA-Target unterschieden werden