Phospholipase A 2 in der Parvovirus MVMp induzierten Zelllyse

Das autonome Parvovirus Minute Virus of Mice MVMp ist ein onkolytisches Virus, da es selektiv neoplastisch transformierte Zellen infiziert und tötet. Während viele zytotoxische Effekte, die eine MVMp Infektion hervorruft, auf Aktivitäten des viralen NS1 Proteins zurückgeführt wurden, sind die Ursachen der MVMp induzierten Wirtszelllyse und ihr Mechanismus bisher unklar. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, virale und zelluläre Faktoren der MVMp induzierten Zelllyse zu identifizieren. Es wurde vermutet, dass Phospholipase A2 (PLA2) Enzyme, die in sekretorische sPLA2, zytosolische cPLA2 und Ca2+-unabhängige iPLA2 unterteilt werden, aus den folgenden Gründen für diesen Zusammenhang von Bedeutung sein könnten. Zum einen sind sie als Phospholipidhydrolasen, neben der Produktion von Lipidsignalmediatoren, auch als wichtige Effektoren schwerwiegender Membranveränderungen in der Zelle bekannt. Zum anderen verfügt das parvovirale Kapsidprotein VP1 im N-terminalen Bereich selbst über ein PLA2 Motiv. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse zeigten, dass die N-terminale Domäne von VP1 einen essentiellen Beitrag zur MVMp induzierten Zelllyse leistet. Rekombinante MVMp Viren, die für den N-terminalen VP1 Bereich kodierten, wiesen im Vergleich zu Viren, die ausschließlich die NS Proteine exprimierten, eine stark erhöhte lytische Aktivität auf. Experimente mit rekombinanten Viren, die eine inaktivierende Mutation in der katalytischen Domäne dieses PLA2 Motivs enthielten, ließen jedoch darauf schließen, dass der Beitrag dieses Motivs zur Zelllyse nicht in seiner enzymatischen Aktivität begründet ist. Dieses Ergebnis ließ als Ursache für die beobachtete massive Freisetzung von Arachidonsäure (AA) nach der MVMp Infektion, eine Aktivität zellulärer PLA2 vermuten. AA ist ein gängiges Produkt der PLA2 katalysierten Phospholipidhydrolyse und konnte, korrelierend mit der virusinduzierten Zelllyse, im Kulturüberstand infizierter Zellen detektiert werden. Dass es sich hierbei nicht um einen Nebeneffekt der Zelllyse, sondern einen enzymatisch regulierten Prozess in den noch intakten Zellen handelte, konnte durch den Nachweis einer virusinduzierten, starken Freisetzung von Prostaglandin E2, einem Produkt des AA Metabolismus, bekräftigt werden. In anschließenden Experimenten konnte unter Verwendung etablierter selektiver PLA2 Inhibitoren sowohl die virusinduzierte AA-Freisetzung als auch die Zelllyse gehemmt werden. Die genaue Untersuchung im Hinblick auf die Aktivierung dieser Enyzme ergab, dass cPLA2 infolge der MVMp Infektion an einer für die katalytische Aktivität essentiellen Phosphorylierungsstelle phosphoryliert wird und an intrazellulären Membrankompartimenten akkumuliert. Der Nachweis einer Aktivierung von p38 und p44/42 MAPK, einem der cPLA2 Phosphorylierung vorgeschalteten Ereignis, bestätigte dieses Ergebnis. Während ein Beitrag zellulärer iPLA2 ausgeschlossen wurde, konnte die Bedeutung zellulärer sekretorischer sPLA2 hingegen nicht vollständig klargestellt werden. Basierend auf den hier gezeigten Ergebnissen muss davon ausgegangen werden, dass die MVMp Infektion keine Sekretion des Enzyms hervorruft. Eine intrazelluläre Funktion einzelner sPLA2 Subtypen konnte allerdings nicht ausgeschlossen werden. Des Weiteren geben Untersuchungen mit einem in den NS Proteinen mutierten, hypolytischen MVMp Virus Hinweise darauf, dass auch die viralen NS Proteine eine wichtige Rolle in der MVMp induzierten Zelllyse spielen, da die bei einer wildtyp MVMp Infektion nachgewiesene Stimulation der MAPK und Aktivierung der cPLA2 bei einer Infektion mit diesem Virus ausbleiben. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig gezeigt, dass cPLA2 Enzyme, als zelluläre Faktoren, und die N-terminale Domäne des VP1 Proteins, als viraler Faktor, erheblich zur Parvovirus MVMp induzierten Zelllyse beitragen