Proteinanalyse zur Charakterisierung der Lebensformen von Stigmatella aurantiaca

Um Veränderungen im Proteom während der unterschiedlichen Wachstums- und Entwicklungsphasen des Prokaryonten Stigmatella aurantiaca zu detektieren, wurden Proteinextrakte, die aus Zellen verschiedener Lebenszustände stammen, in einer zweidimensionalen Gelelektrophorese (2D) aufgetrennt. Tatsächlich änderten sich die Protein-Muster während der Entwicklung zum Fruchtkörper bemerkenswert. Proteinspots erscheinen und verschwinden, was auf eine entwicklungsspezifische Synthese und Degradierung von Polypeptiden schließen läßt. Eine Charakterisierung und Identifizierung dieser Polypeptide erfolgte durch die Massenspektrometrie. Partielle Sequenzen (bis zu 10 Aminosäuren), abge-leitet aus dem massenspektrometrischen Fragmentierungsmuster, wurden mit Polypeptidsequenzen in Protein-Bibliotheken verglichen. Diese Analyse resultiert in einer Zuweisung zu bestimmten bekannten Proteinen. Auf diese Weise können Polypeptide, spezifisch für vegetative Zellen, Sporen aus Indol-behandelten Zellen oder Fruchtkörper analysiert werden. Ein Protein konnte als der Elongationsfaktor TU, ein anderes als die verzweigte Kette der b-Untereinheit der Oxocarbonsäure Dehydrogenase (E1) von S. aurantiaca bestimmt werden. Eine weitere Homologie besteht zu einer ATP-abhängigen Clp Protease (Homolog CD4A der ATP-bindenden Untereinheit ClpA�s) von Lycopersicon esculentum, der Tomate, einem Eukaryont. Somit könnte auch bei S. aurantiaca eine Proteolyse von Proteinen durch das clp-System stattfinden. Für die Isolierung hochmolekularer Proteasen, die wahrscheinlich an der Entwicklung beteiligt sind, wurden Zelllysate verschiedener Wachstums- und Entwicklungsstadien von S. aurantiaca mittels einer Sucrosedichtegradienten-Zentrifugation fraktioniert. Die Enzymaktivität wurde mit einem proteasom-spezifischen Substrat bestimmt, während die übliche proteolytische Aktivität von Serin-, Aspartatsäure-, Thio- und Metalloproteasen gehemmt wurde. Das tatsächlich proteasomale Aktivität vorhanden ist, wurde durch die Verwendung eines spezifischen Antiserums gegen die 20S Untereinheit des Proteasoms des Archaea Thermoplasma acidophilum bestätigt. Die Verteilung der Enzymaktivität über den Sucrosedichtegradienten läßt den Schluß zu, daß S. aurantiaca hochmolekulare Proteasen beherbergt. Diese könnten für die Degradierung von Polypeptiden während des Entwicklungszyklus verantwortlich sein. Eine An-reicherung und Reinigung vermeintlicher hochmolekularer Proteasen wurde durch verschiedene chromatographische Verfahren erreicht. Fraktionen mit einer möglichen Proteasomaktivität wurden mittels 2D analysiert. Die bis jetzt gewonnen Daten weisen darauf hin, daß Proteine mit einer proteasomalen Funktion/Aktivität vorhanden sind, die am Entwicklungszyklus von S. aurantiaca beteiligt sind