Untersuchungen zur nichtinvasiven Tetrazyklin-abhängigen Kontrolle von Genaktivitäten in vivo

Die konditionale Inaktivierung endogener Gene ist eine wirksame Strategie zur Analyse von Genfunktionen in transgenen Tieren. Den besten Beweis für die Funktionalität eines Genprodukts liefert hierbei die reversible Steuerung der Expression des zu untersuchenden Gens durch einen exogenen Induktor in den transgenen Organismen. Dabei hat sich in den letzten Jahren das Tetrazyklin-kontrollierte Genregulationssystem (Tet-System) durchgesetzt. Mit dem Tet-System gelang die Übertragung der stringenten Expressionskontrolle der Regulationselemente des Tetrazyklin-Resistenzoperons von Tn10 in eukaryontische Zellen, wo nun der Tetrazyklin-abhängige Transaktivator tTA durch die Konzentration des Induktors Doxyzyklin (Dox) die Aktivität des Tetrazyklin-regulierbaren Promotors Ptet graduell über einen Expressionsbereich von 5 Größenordnungen reguliert. In transgenen Mäusen ist dieses Regulationsprinzip bereits in über hundert Fällen erfolgreich zur organ- bzw. zelltypspezifischen Untersuchung von Genfunktionen eingesetzt worden, wobei allerdings in den meisten Fällen die regulierte Überexpression eines Gens oder einer dominant aktiven Mutante verwirklicht wurde. Ziel dieser Arbeit war es eine Methodik zu etablieren, mit der die Funktion eines endogenen Gens unter Verwendung des Tet-System in vivo reversibel und graduell steuerbar ist. Der entscheidende Punkt eines solchen Konzeptes ist es, den chromosomalen Lokus des zu untersuchenden Gens unberührt zu lassen, was ein unbeeinträchtigtes Expressionsmuster im nicht-induzierten Zustand garantiert. Diese Art von Regulation eignet sich besonders für Gene, deren Inaktivierung zu einer kompensatorischen Embryonalentwicklung oder zum embryonalen bzw. frühen postnatalen Tod der Tiere führt. Das im Rahmen dieser Arbeit untersuchte Gen ist nr1, die essentielle Untereinheit des NMDA-Rezeptors. Der NMDA-Rezeptor ist an den Prozessen der synaptischen Plastizität beteiligt, die in direkten Zusammenhang mit der Lern- und Gedächtnisleistung in Säugern stehen. Im ersten Teil der Arbeit ging es um die Etablierung einer transgenen Mauslinie, in welcher der optimierte reverse Transaktivator rtTA2S-M2 unter der Kontrolle des aCamKII-Promotors synthetisiert wird. Durch die sehr guten Regulationseigenschaften von rtTA2S-M2 in Zellkultur war erwartet worden, in der transgenen Linie die Tet-regulierte Genexpression durch die Verabreichung geringer Mengen Induktor im Trinkwasser im Bereich des Großhirn zu ermöglichen. Die Summe der erzielten Ergebnisse mit mehreren Mauslinien zeigt jedoch, daß die Blut-Hirn-Schranke den Transport von Dox in das Großhirn in der Weise limitiert, daß nur eine partielle Induktion des Tet-System durch die üblichen Applikationsmethoden erreicht wird. Selbst durch die massive Verabreichung des Induktors C4, der in zehnfach geringeren Mengen als Dox die rtTA2S-M2 vermittelte Genexpression maximal aktiviert, konnte keine maximale Expression erreicht werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurden verschiedene Strategien zur nichtinvasiven Regulation endogener Genfunktionen evaluiert. Dabei wurde zuerst der Einsatz von Hammerhead-Ribozymen untersucht, welche die NR1 mRNA katalytisch spalten und sie damit inaktivieren. Durch zwei verschiedene Selektionsverfahren konnten Hammerhead-Ribozyme identifiziert werden, die zwar in vitro gute Spaltungsaktivitäten und z. T. neuartigen Bindungseigenschaften an die Substrat-RNA aufwiesen, sich jedoch in einem quantitativen zellulären Testsystem als unwirksam in Bezug auf die Produktion eines NR1-Luziferase-Fusionsproteins herausstellten. Desweiteren kamen RNA-Padlocks zum Einsatz, die durch eine sequenzspezifische Bindung an die mRNA und die Ausbildung eines kovalent verknüpften Ringes um die RNA dessen Translation inhibieren sollen. Doch obwohl hier sehr schnelle Komplexierungskinetiken und stabile Bindungseigenschaften an die Substrat-RNA mit den RNA-Padlocks in vitro erzielt wurden, reichte dies für eine Verhinderung der Synthese des NR1-Luziferase-Fusionsproteins im zellulären Testsystem nicht aus. Zuletzt wurde der Einsatz von synthetischen Transkriptionsfaktoren mit Zinkfinger-DNA-Bindungsdomänen untersucht. Durch die Fusion von Zinkfingerproteinen (ZIF) mit genomspezifischen Bindungseigenschaften mit einer entsprechenden eukaryontischen Repressionsdomäne sollte die Interferenz mit dem funktionalen Programm des "TATA-losen" NR1 Promotors zur Unterdrückung der Genexpression möglich sein. Dabei konnte ein ZIF-Fusionsprotein mit einer Repressionsdomäne des Transkriptionsfaktors REST identifiziert werden (ZIF/REST 5-6), mit dem die Unterdrückung der Expression des NR1-Promotors in gleichen Maße möglich war wie mit REST selbst, der die Expression dieses Promotor nur in nichtneuroalen Geweben unterbindet