Rekombinante Hepatitis B Viren-Vektoren als Werkzeuge für Molekularbiologie und Therapie : Optimierung eines Systems

Hepatitis B Virus (HBV) - Vektoren sind vielversprechende Kandidaten für einen lebergerichteten Gentransfer, da sie bevorzugt Hepatozyten infizieren und ihre Genexpression hepatozytenspezifisch ist. Es war bekannt, dass infektiöse HBV produziert werden konnten, in denen das kleine Hüllprotein (S) durch das grün fluoreszierende Protein (GFP) ersetzt wurde. Nach Infektion primärer humaner Hepatozyten (PHH) mit diesen Viren zeigten einzelne Zellen eine grüne Fluoreszenz. Der Einsatz von HBV-Vektoren ist einerseits als Werkzeug in der Molekularbiologie und andererseits in der Therapie von Lebererkrankungen denkbar. In der vorliegenden Arbeit sollte der Nachweis eines Gentransfers verbessert sowie die Transgenkapazität exakt bestimmt und vergrößert werden. Im Hinblick auf eine mögliche Therapie von chronischer Hepatitis B oder C sollte ein lebergerichteter Interferontransfer etabliert werden. Der Gentansfers in Hepatozyten durch Infektion konnte erst reproduzierbar untersucht werden, als PHH als Testsystem für die Vektoren etabliert waren und die Virusausbeute durch die Verwendung von Lipofektion sowie serumfreiem Medium bei der Virusproduktion 10fach erhöht wurde. Durch das Ersetzen des preS2/S-Promoters durch den Transthyretin-Promoter konnte eine Infektion von lebenden PHH zu einem früheren Zeitpunkt nachgewiesen werden, ohne die Leberspezifität des Promotors zu verlieren. Mit Renilla-Luziferase als Transgen gelang es, den Nachweis einer Infektion zu vereinfachen und quantifizierbare Ergebnisse zu erhalten. Diese Viren ermöglichten es, die Transgenkapazität und die Genexpression der HBV-Vektoren genauer zu untersuchen. Da die HBV-Vektoren eine über 400 bp hinausgehende Überlänge des Genoms nicht tolerierten, konnte die Transgenkapazität von ca. 800 bp nur durch Einführung weiterer Deletionen im viralen Genom vergrößert werden. Eine andere genomische Deletion erhöhte die Genexpression 5fach. Für einen lebergerichteten Interferontransfer wurden sowohl adenovirale Vektoren als auch HBV-Vektoren benutzt. Mit beiden Systemen gelang es, Viren zu produzieren, und mit beiden Vektoren war es auch möglich, Interferon-Expression in infizierten PHH nachzuweisen. Durch diese Verbesserungen stellen die HBV-Vektoren ein Werkzeug zur mikroskopischen Identifikation infizierter, lebender PHH in Zellkultur da. Mit den Luziferase exprimierenden Viren ist es möglich, die Infektion einer gesamten Kulturschale zu quantifizieren und den Einfluss von Änderungen im viralen Genom auf Infektiösität, Transkription und Genexpression zu untersuchen. Interferon exprimierende HBV-Vektoren werden aktuell im Schimpansen Modell der chronischen Hepatitis C getestet