Analyse der metabolischen Anpassung von Streptococcus pneumoniae an antimikrobielle Umwelteinflüsse

Das Gram-positive Bakterium Streptococcus pneumoniae ist ein humanspezifisches Pathogen des oberen Respirationstraktes. Der opportunistische Krankheitserreger kann jedoch mehrere Organe befallen und tiefer in den Körper vordringen, was zu lokalen Entzündungen wie Sinusitis und Otitis media oder zu lebensbedrohlichen Infektionen wie Pneumonie, Meningitis oder Sepsis führen kann. Für das Bakterium S. pneumoniae wurden bisher kaum Metabolom-Daten erhoben. Daher war das Ziel dieser Dissertation eine umfassende Charakterisierung des Metaboloms von S. pneumoniae. In dieser Dissertation wurden als analytische Methoden die Gaschromatografie (GC) und Flüssigkeitschromatografie (LC) jeweils gekoppelt mit Massenspektrometrie (MS) sowie die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) verwendet, um die Metaboliten zu analysieren. Es sind mehrere Analysetechniken erforderlich, um den Großteil des Metaboloms mit seinen chemisch verschiedenen Metaboliten zu erfassen. Artikel I fasst die Literatur zu Untersuchungen des Metabolismus von S. pneumoniae in den letzten Jahren zusammen. Um eine Momentaufnahme des biologischen Systems zum jeweiligen Zeitpunkt zu erhalten, ist neben dem reproduzierbaren Wachstum während der Kultivierung auch die exakte Probenahme zu beachten. Aus diesem Grund wurde in dieser Dissertation ein Probenahmeprotokoll für das Endometabolom von S. pneumoniae etabliert (Artikel II). Mithilfe des optimierten Protokolls wurde eine umfassende Metabolomanalyse in einem chemisch definierten Medium durchgeführt (Artikel II). Um S. pneumoniae in einer Umgebung ähnlich der im Wirt zu untersuchen, wurde in einem modifizierten Zellkulturmedium kultiviert. Intermediate zentraler Stoffwechselwege von S. pneumoniae wurden analysiert. Das intrazelluläre Stoffwechselprofil wies auf einen hohen glykolytischen Flux hin und bot Einblicke in den Peptidoglykan-Stoffwechsel. Darüber hinaus widerspiegelten die Ergebnisse die biochemische Abhängigkeit von S. pneumoniae von aus dem Wirt stammenden Nährstoffen. Ein umfassendes Verständnis der Stoffwechselwege von Pathogenen ist wichtig, um Erkenntnisse über die Anpassungsstrategien während einer Infektion zu gewinnen und so neue Angriffspunkte für Wirkstoffe zu identifizieren. Die zunehmende Verbreitung von resistenten S. pneumoniae-Stämmen zwingt zur Suche nach neuen antibiotisch wirksamen Substanzen. Im Zuge dessen wurde in Artikel III die metabolische Reaktion von S. pneumoniae während des Wachstums unter dem Einfluss antibakterieller Substanzen mit dem Ziel der Identifizierung metabolischer Anpassungsprozesse untersucht. Dabei wurden Antibiotika mit unterschiedlichen Wirkmechanismen verwendet, wie die Beeinflussung der Zellwandbiosynthese (Cefotaxim, Teixobactin-Arg10), der Proteinbiosynthese (Azithromycin) sowie Nukleotidsynthese (Moxifloxacin). Es konnten keine Wirkmechanismus-spezifischen Marker-Metaboliten identifiziert werden. Jedes Antibiotikum verursachte weitreichende Veränderungen im gesamten Metabolom von S. pneumoniae. Die Nukleotid- und Zellwandsynthese waren am stärksten betroffen. Besonders vielversprechend sind Antibiotika mit zwei Wirkorten wie Teixobactin-Arg10 und Kombinationen aus zwei Antibiotika. In dieser Dissertation wurde das erste Mal das synthetisch hergestellte Teixobactin-Arg10 mittels einer der modernen OMICS-Techniken untersucht. Die vorliegende umfassende Metabolom-Studie bietet wertvolle Erkenntnisse für Forscher, die an der Identifizierung neuer antibakterieller Substanzen arbeiten. Insgesamt tragen die Ergebnisse der Dissertation zu einem besseren Verständnis der bakteriellen Physiologie bei.The Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae is a human-specific pathogen of the upper respiratory tract. The opportunistic pathogen can infect multiple organs and penetrate deeper into the body, leading to local inflammation such as sinusitis and otitis media. Life-threatening infections such as pneumonia, meningitis or sepsis are possible. S. pneumoniae is poorly understood on the metabolome level. Therefore, the aim of this thesis was a comprehensive characterization of the metabolome of S. pneumoniae. Within the present thesis, gas chromatography (GC) and liquid chromatography (LC) coupled with mass spectrometry (MS) as well as nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) were used to analyze the metabolome of S. pneumoniae, since there are several bioanalytical approaches are necessary to investigate the metabolome and its chemically different metabolites. Within this context Article I summarizes the known metabolome studies of S. pneumoniae. The basis metabolome of S. pneumoniae was elucidated using the aforementioned techniques. Here especially the reproducible growth during the cultivation and the sampling procedure must be developed and optimized. A sampling protocol for the endometabolome of S. pneumoniae was established in this study (Article II). Using this optimized protocol, a comprehensive metabolome analysis was performed in the chemically defined medium. To study the metabolome of S. pneumoniae in an artifical but close to the environmental conditions medium a modified cell culture medium was used. Intermediates of the central metabolic pathways of S. pneumoniae were analyzed. The intracellular metabolic profile indicates a high glycolytic flux and provided insight into the peptidoglycan metabolism. In addition, the results reflect the biochemical dependence of S. pneumoniae on host-derived nutrients. A comprehensive understanding of the metabolic pathways of pathogens is important to gain insights into adaptation strategies during infection to identify new drug targets. The presented study is the first comprehensive approach of S. pneumoniae. The increasing prevalence of S. pneumoniae strains resistant to commonly used antibiotics is forcing the search for new antimicrobial active substances. The metabolic response of S. pneumoniae during growth under the influence of antibacterial substances was investigated aiming to identify metabolic adaptation processes (Article III). Antibiotics with different mechanisms of action were used. Here compounds interfering with cell wall biosynthesis (cefotaxime, teixobactin-Arg10), protein biosynthesis (azithromycin) and nucleotide synthesis (moxifloxacin) and in combination (cefotaxime + azithromycin) were used. Each antibiotic compound resulted in extensive changes in the entire metabolome of S. pneumoniae but no distinct biomarker on the metabolome level could be identified. Nucleotide and cell wall synthesis were the most affected pathways. Particularly promising are antibiotics with two sites of action such as Teixobactin-Arg10 and the combination of two antibiotics. In this dissertation, Teixobactin-Arg10 was investigated for the first time using metabolomics approach. The presented comprehensive metabolome study provides valuable insights for researchers working on the identification of new antibacterial agents. Overall, the results of the present dissertation contribute to a better understanding of bacterial physiology and the metabolome adaptation of S. pneumoniae