Identification and analysis of urine-derived exosomal miRNAs and BDNF

Morphological changes of the complex 3-D architecture of podocytes as well as the loss of these post-mitotic cells often result in severe kidney disease. Since currently, there are no curative drugs, we focused on the identification of non-invasive biomarkers, allowing an early detection of the onset of such diseases. Therefore, we analyzed the cellular- and the cell-free fractions of urine samples from patients suffering from chronic kidney disease (CKD), especially for injury markers as well as for exosome-derived miRNAs. We identified the mRNA of the neuronal protein brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in the cellular fraction of 120 CKD patients and found that the expression was highly correlated with the mRNA expression of the kidney injury marker molecule 1 (KIM-1). Furthermore, we found that both were correlated with the mRNA expression of the podocyte-specific gene Nephrin (NPHS1), suggesting that podocytes are very likely the cellular source. Beside this, we observed that BDNF is upregulated in biopsies of diabetic patients and seems to be involved in the differentiation of podocytes. Immunofluorescence staining clearly showed that BDNF is localized in the cell body and major processes of podocytes within the glomerulus. Knockdown experiments in zebrafish larvae, a well-established animal model to study kidney function, showed the importance of BDNF on kidney function, morphology and filtration in vivo. Additionally, we analyzed circulating exosomal microRNAs (miRs) isolated from the cell-free urine fraction. After the optimization of a column-based isolation protocol for exosomes, we identified miR-16 from a pre-selected set of candidates as a suitable endogenous reference gene for data normalization. Subsequently, we analyzed the exosomal levels of miR-21, miR-30a-5p and miR-92a in urine samples of 41 CKD patients and 5 healthy controls. We found significantly enhanced levels of miR-21 in CKD patients that were also negatively correlated with the eGFR, suggesting a negative influence on kidney function. MiR-21 was also highly upregulated in de-differentiated glomeruli and in kidneys of nephrotoxic serum- (NTS-) treated mice as an in vivo kidney injury model. To summarize, we identified two promising new and non-invasive biomarkers for CKD in the urine of patients which may also have a functional relevance on kidney function.Morphologische Veränderungen der komplexen 3D-Struktur von Podozyten und der Verlust dieser post-mitotischen Zellen führen häufig zu schweren Nierenerkrankungen. Da es derzeit keinerlei heilende Medikamente gibt, lag der Fokus dieser Arbeit auf der Identifizierung von nicht-invasiven Biomarkern zur Früherkennung dieser Erkrankungen. Diesbezüglich wurden sowohl die zellulären- als auch die Zell-freien Fraktionen aus Urinproben von Patienten untersucht, die an einer chronischen Nierenerkrankung (CKD) leiden. Hierbei wurden besonders exosomale miRNAs und Markermoleküle für einen Nierenschaden untersucht. Wir konnten die mRNA des neuronalen Proteins BDNF in der zellulären Urinfraktion von 120 CKD-Patienten nachweisen und konnten eine Korrelation mit der mRNA des Nierenschadenmarkermoleküls KIM-1 aufzeigen. Zudem war die Expression beider mRNAs mit der des Podozytenmarkerproteins Nephrin korreliert. Dies deutet daraufhin, dass Podozyten zum zellulären Urinanteil beitragen. Zudem konnten wir zeigen, dass BDNF in Urinproben und Biopsien von Patienten mit einer diabetischen Nephropathie hochreguliert ist und für die Dedifferenzierung von Podozyten eine Rolle spielt. Durch Immunfluoreszenzfärbungen konnte gezeigt werden, dass BDNF hauptsächlich im Zellkörper und in Primärfortsätzen von Podozyten lokalisiert ist. In knock-down Versuchen mit Zebrafischlarven konnte weiterhin die Wichtigkeit von BDNF für die Morphologie, Funktion und Filtration der Niere in vivo gezeigt werden. Weiterführend wurden zirkulierende, exosomale miRNAs in der Zell-freien Urinfraktion untersucht. Nachdem eine Säulen-basierte Methode zur Isolation von Exosomen aus Urinproben optimiert wurde, konnte miR-16 als geeignete endogene Kontrolle für exosomale miRNA-Expressionsdaten von CKD-Patienten aus mehreren vorausgewählten Kandidaten identifiziert werden. Darauf basierend, wurden Urinproben von 41 CKD-Patienten und 5 gesunden Kontrollen auf die exosomalen Expressionslevel der miR-92a, miR-21 und miR-30a-5p hin untersucht. Interessanterweise lag miR-21 hochreguliert in CKD-Patienten vor und war negativ mit der eGFR korreliert, was einen Hinweis auf einen negativen Einfluss auf die Nierenfunktion gibt. MiR-21 war zudem hochreguliert in dedifferenzierten Glomeruli und in Nieren von NTS-behandelten Mäusen, als in vivo Schadensmodell. Zusammenfassend konnten wir zwei nicht-invasive, potentielle Biomarker für CKD in Urinproben identifizieren, die zudem einen funktionellen Einfluss auf die Niere haben