Vergleich der Zelltodmechanismen nach Temoporfin-basierter Photodynamischer Therapie und Kombination mit Platin(II)-Komplexen oder Glutathionperoxidase-Inhibitoren in humanen Krebszelllinien

Das Porphyrin-Derivat 5,10,15,20-tetra(m-Hydroxyphenyl)chlorin (mTHPC, Temoporfin), in Europa zugelassen unter dem Handelsnamen Foscan®, stellt einen der vielversprechendsten Photosensibilisatoren (PS) in der Photodynamischen Therapie (PDT) dar. Während einige Publikationen über die Aktivität von Temoporfin in einzelnen Krebszelllinien in der Fachliteratur erschienen sind, fehlen systematische Studien über die Temoporfin-basierte PDT, die mithilfe eines Sets aus mehreren Krebszelllinien durchgeführt wurden. In der vorliegenden Dissertation wurden fünf humane, adhärente Krebszelllinien aus dem Kopf-Hals-Bereich und weiteren PDT-relevanten Geweben eingesetzt, um die Auslösung von oxidativem Stress und die zugrundeliegenden Zelltodmechanismen der Temoporfin-basierten PDT in vitro zu untersuchen. Dafür wurde zunächst die Viabilität der Zellen nach Temoporfin-Behandlung (0,001–5,0 µmol/L) und Bestrahlung mit einer LED-basierter Apparatur (0,2–5,5 J/cm2) im MTT-Test ermittelt und Konzentrations-Wirkungskurven zur Bestimmung von IC50- und IC90-Werten aufgenommen. Zur Untersuchung und zum Vergleich der Zelltodmechanismen in den Zelllinien wurden diese anschließend mit äquitoxischen Konzentrationen des Temoporfins behandelt und mit vorrangig mit einer Lichtdosis von 1,8 J/cm2 (vereinzelt auch 3,5 oder 7,0 J/cm2) bestrahlt. Die Analytik der Zellen erfolgte direkt, 6, 24, oder 48 h nach der Bestrahlung. Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation bestätigen die Auslösung von oxidativem Stress nach der Temoporfin-PDT durch die Detektion eines Totalverlustes des mitochondrialen Membranpotentials (Δψm) sowie einer erhöhten Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS). Eine Lipidperoxidation (LPO) sowie die Beteiligung einer Nekrose am Zelltod spielen hingegen in den meisten Zelllinien eine untergeordnete Rolle. Vor allem die ausbleibende Nekrose nach einer hochdosierten PDT mit Temoporfin steht dabei in Kontrast zu den Resultaten vieler publizierter Studien. Als vorherrschender Zelltodmechanismus wurde nach Temoporfin-vermittelter PDT stattdessen über eine Phosphatidylserin-Externalisierung, eine Caspase 3-Aktivierung und eine PARP-Spaltung eine Auslösung von Apoptose identifiziert. Zudem kann parallel zur Apoptose eine Autophagie ausgelöst werden bzw. kann diese zunächst sogar dominieren, bevor sie zu einer Autophagie-assoziierten Apoptose führt. Als Anzeichen der späten Phase einer Apoptose ist zudem früher oder später eine DNA-Fragmentierung nachweisbar, und der Zelltod wird in einigen Fällen von einem Zellzyklusarrest in der G2/M-Phase begleitet. Neben der Auswertung der Zelltodmechanismen wurde ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Dissertation auf den Vergleich der Ergebnisse aus verschiedenen, identisch behandelten Zelllinien gelegt. Obwohl die Zellen unter äquitoxischen Bedingungen behandelt wurden und die PDT über eine vergleichsweise unspezifische Bildung von ROS wirkt, wurden sehr heterogene Resultate in den unterschiedlichen Zelllinien erhalten. Die vorliegende Untersuchung zeigt deshalb außerdem, dass generelle Schlussfolgerungen nach einer PDT eine Analytik in mehreren unterschiedlichen Zelllinien benötigt, um verlässlich zu sein. Dieser Umstand ist in der Vergangenheit in In-vitro-Studien zur PDT jedoch viel zu häufig ignoriert worden. Die Pt(II)-Komplexe Carboplatin (CBDCA), Cisplatin (CDDP) und Oxaliplatin (1-OHP) werden als Zytostatika in einer Vielzahl chemotherapeutischer Verfahren eingesetzt. In der vorliegenden Dissertation wurden die Pt(II)-Komplexe CBDCA, CDDP, oder 1-OHP in fünf humanen, adhärenten Krebszelllinien mit einer Temoporfin-basierten PDT kombiniert. Die Zellviabilität wurde im MTT-Test bestimmt und synergistische Effekte der Kombination mithilfe der Berechnung von Combination Indices (CI) ermittelt. Synergismus wurde dabei nach einigen Kombinationen, z.B. mit 1-OHP in drei der fünf getesteten Zelllinien, beobachtet, aber auch antagonistische Effekte wurden für einige Kombinationen in bestimmten Zelllinien detektiert. Im Fall einer Synergie wurden erhöhte ROS-Level nachgewiesen, jedoch wurde die Auslösung von Apoptose im Vergleich zu einer Behandlung mit den Pt(II)-Komplexen bzw. der PDT allein dadurch nicht notwendigerweise verstärkt. Eine Analyse der Zellzyklusverteilung ergab, dass nach kombinierter Behandlung sub-G1-Populationen mit fragmentierter DNA, die für eine späte Phase der Apoptose charakteristisch sind, gebildet werden, und zudem S-Phase und G2/M-Arreste vorliegen. Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation zeigen, dass eine Behandlung mit einer Temoporfin-basierten PDT das Potential besitzt, einige Typen von Tumorzellen gegenüber Pt(II)-Komplexen, vor allem 1-OHP, zu sensibilisieren und so besser für die Tumortherapie zugänglich zu machen. Das Erreichen synergistischer Effekte hängt dabei jedoch in hohem Maße vom Ursprungsgewebe und tumorspezifischen Eigenschaften der Zellen ab und es können sogar antagonistische Effekte auftreten. Die Glutathionperoxidase 1 (GPX1) kann bei einer Überexpression in Tumorzellen zu einer Inhibition von Apoptose führen, was zum Überleben der Tumorzellen beiträgt. Zudem kann eine erhöhte GPX-Aktivität zu einer Resistenzentwicklung gegenüber oxidativen Schäden beitragen, was den Tumor z.B. vor Chemotherapeutika schützen kann. Potential in der Tumortherapie besitzen deshalb GPX-Inhibitoren, die einer Überexpression der GPX1 durch Verringerung der Gesamtaktivität entgegen¬wirken. In Kombination mit Chemotherapeutika führten GPX-Inhibitoren so bereits zu einer Re-Sensibilisierung Zytostatika-resistenter Zelllinien. In der vorliegenden Dissertation wurde eine Kombination der GPX-Inhibitoren 9-Chlor-6-ethyl-6H-[1,2,3,4,5]pentathiepino[6,7-b]indol (CEPI), ein kürzlich synthetisiertes trizyklisches Pentathiepin, oder Mercaptobernsteinsäure (MBS), der klassische Inhibitor der GPX in vielen veröffentlichten Studien, mit einer Temoporfin-PDT eingesetzt, um durch die Blockierung eines effektiven Abbauweges für H2O2 eine vermehrte Akkumulation von ROS zu erzeugen und so den phototoxischen Effekt des Temoporfins zu verstärken. Synergismus wurde dabei nach Kombination mit beiden GPX-Inhibitoren, jedoch nicht in allen fünf Zelllinien, beobachtet. Auf der anderen Seite wurden mit beiden Inhibitoren auch antagonistische Effekte in bestimmten Zelllinien detektiert. Die ROS-Level konnten nach kombinierter Behandlung mit CEPI, nicht jedoch mit MBS, in einigen Zelllinien gesteigert werden, was darauf hindeutet, dass die Inhibition der GPX durch CEPI tatsächlich zu einer zusätzlichen Akkumulation von ROS führt. Beide Inhibitoren erzeugen allein keine Steigerung der ROS-Spiegel. Überraschenderweise wurde eine vermehrte Apoptoseauslösung anschließend jedoch nach Kombination mit beiden GPX-Inhibitoren in allen untersuchten Zelllinien erreicht, was darauf schließen lässt, dass weitere Faktoren die Induktion von Apoptose fördern, z.B. eine Autophagie-assoziierter Zelltodmechanismus oder eine Ferroptose, die durch LPO nach Verlust der GPX4-Aktivität eingeleitet wird. Die erhöhte Apoptoseauslösung wurde zudem in der Zellzyklusanalyse bestätigt, in der nach kombinierter Behandlung mit beiden GPX1-Inhibitoren erhöhte Anteile apoptotischer sub-G1-Frak¬tionen mit fragmentierter DNA nachweisbar waren. Zudem wurde die DNA-Fragmentierung nach Kombination mit MBS von einem gesteigerten G2/M-Arrest begleitet. Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation zeigen, dass eine Kombination von Inhibitoren der GPX mit einer Temoporfin-basierten PDT zu synergistischen Effekten führen kann, wodurch eine Verstärkung der Phototoxizität möglich ist. Da die Inhibitoren in nicht-toxischen Konzentrationen eingesetzt werden, werden zudem keine zusätzlichen Nebenwirkungen erwartet. Der Erfolg des kombinierten Ansatzes hängt dabei jedoch in hohem Maße vom Ursprungsgewebe und tumorspezifischen Eigenschaften der Zellen ab, aber auch antagonistische Effekte können auftreten.One of the most promising photosensitizers (PS) used in photodynamic therapy (PDT) is the porphyrin derivative 5,10,15,20-tetra(m-hydroxyphenyl)chlorin (mTHPC, temoporfin), marketed in Europe under the trade name Foscan®. While some reports on the activity of mTHPC in individual human cancer cell lines have appeared in the literature, systematic studies on the photodynamic effects of mTHPC on panels of cancer cell lines have not been published. In this thesis, a panel of five human adherent cancer cell lines from head and neck and other PDT-relevant tissues was used to investigate oxidative stress and underlying cell death mechanisms of mTHPC-mediated PDT in vitro. First, cellular viability was assessed with the MTT assay after treatment with temoporfin (0.001–5.0 µmol/L) and illumination with an LED-based device (0.2–5.5 J/cm2), and dose-response curves were plotted for the determination of IC50 and IC90 values. For further analysis and comparison of cellular death mechanisms, cells were treated with mTHPC in equitoxic concentrations and preferably illuminated with a light dose of 1.8 J/cm2 (in some cases 3.5 or 7.0 J/cm2). Cells were then harvested immediately, 6, 24, or 48 h post illumination for analyses. Results of the present thesis confirm the induction of oxidative stress after mTHPC-based PDT by detecting a total loss of mitochondrial membrane potential (Δψm) and increased formation of reactive oxygen species (ROS). However, lipid peroxidation (LPO) and loss of cell membrane integrity play only a minor role in cell death in most of the cell lines. In particular, cell death by necrosis, which has previously been reported in a number of studies to be the cause of cell death by PDT, was absent after high-dose PDT in the present work. Based on the results of the presented thesis, apoptosis is the predominant death mechanism following mTHPC-mediated PDT, confirmed by phosphatidylserine externalization, caspase 3 activation and PARP cleavage. Autophagy can occur in parallel to apoptosis or the former can be dominant first, yet ultimately leading to autophagy-associated apoptosis. The death of the cells is in some cases accompanied by DNA fragmentation and a G2/M phase arrest. Besides the evaluation of the underlying cell death mechanisms, this thesis focused on comparing and contrasting results in a panel of five identically treated cell lines. Although cells were treated under equitoxic conditions and PDT acts via a rather unspecific ROS formation, very heterogeneous results were obtained with different cell lines. The results show that general conclusions after PDT in vitro require testing on several cell lines to be reliable, which has too often been ignored in the past. The platinum(II) complexes carboplatin (CBDCA), cisplatin (CDDP) and oxaliplatin (1-OHP) are used as anticancer drugs in a large number of tumor chemotherapy regimens. In the present thesis, a combination of Pt(II) complexes CBDCA, CDDP, or 1-OHP and mTHPC-mediated PDT was applied to a panel of five human cancer cell lines. Cellular viability was determined by the MTT assay and synergistic effects on viability were evaluated by calculation of Combination Indices (CI). Synergy was identified in some of the combinations, for example, with 1-OHP in three of the tested cell lines but antagonism was also observed for a number of combinations in certain cell lines. In cases of synergy, elevated levels of ROS were observed after combination, but apoptosis induction was not necessarily increased compared to a treatment with a single compound. Cell cycle analysis revealed a formation of apoptotic subG1 populations and S phase as well as G2/M phase arrests after combination. The results of the present thesis show that pre-treatment with mTHPC-PDT has the potential to sensitize some types of tumor cells towards Pt(II) complexes, in particular 1-OHP. Synergy is highly dependent on the type of cancer, and even antagonistic effects may occur. Overexpression of glutathione peroxidase 1 (GPX) can lead to inhibition of apoptosis in tumor cells, and thereby support tumor survival. Furthermore, an enhanced GPX activity can lead to the development of resistance against oxidative damages, protecting the tumor against chemotherapeutic agents. Therefore, GPX inhibitors have the potential to be used in cancer treatment, because they counteract overexpression of GPX by lowering total GPX activity. In the present thesis, a combination of the GPX inhibitors 9-chloro-6-ethyl-6H-[1,2,3,4,5]pentathiepino[6,7-b]indole (CEPI), a recently synthesized tricyclic pentathiepin, or mercaptosuccinic acid (MSA), the classical GPX inhibitor used in many published studies, and temoporfin-mediated PDT were used. It was intended to lead to an accumulation of ROS via the blockage of an effective route of H2O2 degradation, which may enhance the phototoxic effect of temoporfin-PDT. Synergy was identified after combination with both GPX inhibitors, but not with all cell lines. On the other hand, antagonistic effects were observed with both inhibitors in certain cell lines as well. ROS levels were increased after combined treatment with temoporfin and CEPI, but not with MSA, in some cell lines, indicating that inhibition of GPX with CEPI indeed leads to accumulation of ROS. Both GPX inhibitors alone were not able to increase ROS levels. Surprisingly, enhanced apoptosis induction was observed after combination with both inhibitors afterwards, suggesting that other pathways may lead to the induction of apoptosis, for example an autophagy-associated cell death mechanism, or ferroptosis, which is initiated by LPO after loss of GPX4 activity. Enhanced apoptosis was confirmed during cell cycle analysis by an increased apoptotic sub-G1 population with fragmented DNA. Furthermore, in the case of MBS combination, DNA fragmentation may be accompanied by G2/M arrest. The results of the present thesis show, that a combination of GPX inhibitors with temoporfin-mediated PDT can generate synergistic effects, which may lead to increased phototoxic effects. As the inhibitors are used in non-toxic concentrations, no additional side effects would be expected. However, the success of a combined approach is highly dependent on the type of cancer as well as tumor-specific proper-ties, and even antagonistic effects may occur