Development of translational biopharmaceutical assays for biorelevant dissolution and precipitation testing of poorly soluble drugs

From a biopharmaceutical point of view, poor oral bioavailability of a drug is one of the greatest challenges for formulation scientists. The majority of new chemical entities (NCEs) are weakly basic drugs. Consequently, these drugs exhibit pH-dependent solubility, being higher under acidic conditions in the fasted stomach and lower under neutral conditions in the small intestine, the main site of drug absorption. For theses compounds, pH-dependent precipitation testing represents a key parameter during early development stages. In this development phase, the amount of drug available is limited, and fast and detailed investigations of simulated drug solubility are desired. Therefore, an automated small-scale in vitro transfer model, simulating drug transfer from a donor (stomach; simulated gastric fluid, SGF pH 2.0) to an acceptor (small intestine; fasted state simulated intestinal fluid, FaSSIF-phosphate pH 6.5) compartment, has been developed. In contrast to the originally published transfer model, this model allowed a detailed investigation of drug supersaturation and precipitation in a small-scale, feasible for pre-formulation purposes, through miniaturization and automation in an in-line analytical set-up. In-line drug concentration analysis in turbid samples, due to pH-dependent drug precipitation, was achieved by a pre-filtration step, the use of flow-through cuvettes and the application of UV derivative spectroscopy. Compared to the common procedure of manual sampling followed by HPLC-UV analysis for concentration determination, the supersaturation and precipitation of the model drug ketoconazole was more accurately captured by the newly developed in-line analytical set-up. In addition, the newly developed small-scale model was compared to a USP II-based transfer model, representing an established scale of the transfer model. Using a physiologically relevant simulated gastric emptying rate of 5 min half-time, supersaturation and precipitation of the model drugs ketoconazole and a new chemical entity from the research laboratories of Merck Healthcare KGaA, MSC-A, were observed to be highly comparable. Following miniaturization and automation, the developed small-scale model was used to establish eight physiologically relevant test-sets. These test-sets were used to assess the impact of gastrointestinal (GI) variability, i.e. gastric pH, gastric emptying, and GI fluid volumes, on supersaturation and precipitation of two weakly basic model compounds, ketoconazole and MSC-A. The experiments revealed that variations in all GI parameters investigated affected the in vitro supersaturation and precipitation of ketoconazole. For example, faster gastric emptying yielded higher supersaturation and faster precipitation of ketoconazole. In contrast, MSC-A supersaturation and precipitation was only affected by variability in gastric pH. Consequently, the effect of varying GI parameters was found to be drug-specific. Elevated gastric pH, as it can result from co-medication with acid-reducing drugs, resulted in lower degrees of supersaturation for both substances. For ketoconazole, this result is in agreement with the observation that the oral bioavailability of ketoconazole is lowered when proton pump inhibitors are co-administered. In addition to the physiological considerations, the small-scale model developed herein was used to establish an in vitro screening assay for precipitation inhibitors (PIs). The use of PIs represents one option of reducing the process of pH-dependent drug precipitation during simulated GI transfer. For this purpose, ketoconazole and five orally administered kinase inhibitors (i.e. pazopanib, gefitinib, lapatinib, vemurafenib, and MSC-A) were analyzed with and without the polymeric PIs HPMC, HPMCAS, PVPK17 and K30, PEG6000, and Soluplus® in the small-scale transfer model. This screening revealed that at least one effective PI could be identified for each model drug. Moreover, HPMCAS and Soluplus® were the most effective PIs. Another outcome of these studies was that gefitinib expressed highly variable amorphous precipitation which was confirmed by powder X-ray diffraction (PXRD). During the transfer model experiments, the intermediate amorphous and supersaturated state of gefitinib was stabilized using HPMCAS and Soluplus®. After the polymer investigations, the impact of the buffer species in the simulated intestinal medium on drug supersaturation and precipitation was assessed. Since luminal fluids are mainly buffered by hydrogen carbonate ions, a USP II-based transfer model equipped with the pHysio-grad® device was proposed. This allowed the use of a complex bicarbonate buffer for the preparation of FaSSIF-bicarbonate in an in vitro transfer model. Results of transfer model experiments using standard phosphate-based FaSSIF and a more physiologically relevant bicarbonate-based FaSSIF were compared. Therefore, ketoconazole, pazopanib, and lapatinib were analyzed with and without the precipitation inhibitor HPMCAS. While HPMCAS was found to be an effective precipitation inhibitor for all drugs in FaSSIF-phosphate, the effect in FaSSIF-bicarbonate was much less pronounced. Additionally, performed rat PK studies revealed that HPMCAS did not increase the exposure of any of the model compounds significantly, indicating that the transfer model employing bicarbonate-buffered FaSSIF was more predictive compared to the model using phosphate-buffered FaSSIF. The in vitro and in vivo results of these studies demonstrated that the supersaturation precipitation of poorly soluble weakly basic drugs can be significantly affected by GI variability. Furthermore, the use of the automated small-scale transfer model enabled the identification of effective precipitation inhibitors for the model drugs involved in these studies. At the same time the buffer species has been observed to be especially important to reliably predict the in vivo solubility/dissolution behavior of HPMCAS and the weakly basic model drugs.In der Biopharmazie stellen Arzneistoffe mit einer geringen oralen Bioverfügbarkeit eine der größten Herausforderungen während der Entwicklung neuer Medikamente dar. Ein großer Anteil neuer chemischer Wirkstoffe weist dabei einen schwach basischen Charakter mit einhergehender pH-abhängiger Löslichkeit auf. Diese Moleküle sind unter sauren pH-Bedingungen im präprandialen Magen deutlich besser löslich, als unter neutralen pH-Bedingungen im Dünndarm, dem Hauptresorptionsort für gelöste Wirkstoffmoleküle. Entsprechend spielt die Untersuchung der pH-abhängigen Wirkstoffpräzipitation während der Magendarmpassage, besonders in der frühen Entwicklung neuer Wirkstoffkandidaten, eine entscheidende Rolle. Während dieser Entwicklungsstadien stehen jedoch nur geringe Wirkstoffmengen für eine detaillierte und zeitnahe Untersuchung zur Verfügung. Aus diesen Gründen wurde ein automatisiertes, miniaturisiertes In vitro-Transfermodell zur Simulation der Magendarmpassage von Wirkstoffen entwickelt. Im Vergleich zum erstmalig beschriebenem Transfermodell, ermöglicht dieses Modell den Transfer von einem Donorkompartiment (simulierter Magen; simulated gastric fluid, SGF pH 2,0) in ein Akzeptorkompartiment (simulierter Dünndarm; fasted state simulated intestinal fluid, FaSSIF-phosphat pH 6,5) in einem für die Präformulierung geeigneten Maßstab. Neben der Miniaturisierung konnte eine Automatisierung der Analyse der Wirkstoffkonzentration erzielt werden. Die durch Wirkstoffpräzipitation hervorgerufene Trübung wurde dabei durch eine Präfiltration, die Verwendung von Durchflussküvetten und mittels Berechnung der Ableitung der erhaltenen UV Spektren verringert bzw. kompensiert. Im Vergleich zur standardisierten Analyse (manuelle Filtration gefolgt von HPLC-UV Messungen), konnte das simulierte Löslichkeitsverhalten des Modellwirkstoffs Ketoconazol durch Verwendung des automatisierten Modells präziser abgebildet werden. Weiterhin wurde das automatisierte und miniaturisierte Modell mit dem etablierten Modell, basierend auf der USP II Blattrührerapparatur, verglichen. Unter Verwendung einer physiologisch relevanten Transferrate (simulierte Magenentleerung mit einer HWZ von 5 min) konnten vergleichbare Konzentrationszeitprofile der Modellwirkstoffe Ketoconazol und einer Merck Healthcare KGaA Entwicklungssubstanz, MSC-A, demonstriert werden. Anschließend wurden acht physiologisch relevante Testsets, basierend auf dem miniaturisierten Modell, entwickelt. Diese dienten der Untersuchung des Einflusses gastrointestinaler (GI) Variabilität (Magen-pH-Wert, Magenentleerungsgeschwindigkeit, Magen- und Dünndarmvolumen) auf das simulierte Löslichkeitsverhalten von Ketoconazol und MSC-A. Aus diesen Untersuchungen ging hervor, dass das Übersättigungs- und Präzipitationsverhalten von Ketoconazol durch alle betrachteten GI Parameter beeinflusst wurde. Eine schnellere Magenentleerung führte beispielsweise zu einer höheren Übersättigung und schnelleren Präzipitation. Gleichzeitig konnte beobachtet werden, dass diese Effekte wirkstoffspezifisch waren. So wurde das Löslichkeitsverhalten von MSC-A lediglich durch einen veränderten gastralen pH-Wert beeinflusst. Ein erhöhter gastraler pH-Wert führte bei beiden Wirkstoffen zu einer verringerten intestinalen Übersättigung. Für Ketoconazol korrelierten diese Beobachtungen mit den Ergebnissen einer Humanstudie, in der eine verringerte Bioverfügbarkeit des Wirkstoffs nach Einnahme eines Magensäurehemmers beobachtet wurde. Im Anschluss an die physiologischen Untersuchungen wurde ein In vitro-Präzipitationsinhibitor-screening entwickelt. Der Einsatz polymerer Hilfsstoffe (Präzipitationsinhibitoren, PI) repräsentiert eine Möglichkeit, die intestinale Wirkstoffpräzipitation zu verringern, um somit die Resorption von gelösten Molekülen zu steigern. Zu diesem Zweck wurden Ketoconazol und fünf Kinaseinhibitoren (Pazopanib, Gefitinib, Lapatinib, Vemurafenib und MSC-A) mit und ohne PI (HPMC, HPMCAS, PVPK17 und K30, PEG6000 und Soluplus®) im miniaturisierten Transfermodell untersucht. Die Hilfsstoffe HPMCAS und Soluplus® konnten dabei als erfolgreichste PI identifiziert werden, wobei für jeden Wirkstoff eine Verringerung der Präzipitation in Anwesenheit eines Hilfsstoffs erzielt wurde. Weiterhin konnte bei diesen Untersuchungen mittels Festkörperformuntersuchung (Röntgendiffraktometrie, PXRD) anfallender Präzipitate die amorphe Ausfällung des Wirkstoffs Gefitinib bewiesen werden. Zusätzlich war es möglich, diesen höher löslichen Zustand durch die Anwesenheit der PI HPMCAS und Soluplus® zu stabilisieren. Im Anschluss an die durchgeführten Versuche im phosphatpuffer-basierenden Dünndarmmedium wurde der Einfluss der physiologisch relevanten Pufferspezies (Bicarbonat bzw. Hydrogencarbonat) auf das simulierte Löslichkeitsverhalten von Ketoconazol, Pazopanib und Lapatinib untersucht. Zur Stabilisierung des thermodynamisch instabilen Bicarbonatpuffers und zur Verwendung eines physiologisch relevanteren Dünndarmmediums (FaSSIF-bicarbonat) wurde ein USP II-basiertes Transfermodell mit einem pHysio-grad® gekoppelt. Ergebnisse aus phosphat-basierten und bicarbonat-basierten Versuchen in An- und Abwesenheit des PIs HPMCAS wurden für diese Fragestellung verglichen. Während HPMCAS die Präzipitation der drei Modellwirkstoffe in phosphat-gepuffertem FaSSIF effektiv inhibierte, blieb der Polymereffekt im relevanteren bicarbonat-gepufferten FaSSIF aus. Der nicht vorhandene Polymereffekt bestätigte sich weiterhin in durchgeführten Rattenstudien, weshalb der Transfermodell-Ansatz (bicarbonat-basiert) als prädiktiver für das In vivo-Polymer- und Wirkstoffverhalten angesehen werden kann. Die In vitro- und In vivo-Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass das simulierte intestinale Löslichkeitsverhalten schwach basischer und schlecht wasserlöslicher Wirkstoffe zu einem beachtlichen Anteil durch GI Variabilität beeinflusst werden kann. Außerdem konnte das automatisierte, miniaturisierte Transfermodell zur erfolgreichen Identifizierung geeigneter PI eingesetzt werden. Im gleichen Zug war es möglich, den Stellenwert der Simulation eines physiologisch relevanten Puffersystems in Bezug auf die Vorhersage des intestinalen Löslichkeitsverhaltens von Hilfs- und Wirkstoffen zu demonstrieren