Die Rolle von microRNAs in der Chemotherapie-Resistenz des Pankreaskarzinoms

Das Ziel des Projektes war die Untersuchung der erworbenen Chemotherapie-Resistenz des Pankreaskarzinoms gegenüber den Zytostatika 5FU und Gemcitabin in Hinblick auf eine potentielle Regulation durch microRNAs. Im ersten Schritt wurden Zelllinien mit einer intrinsischen Sensitivität identifiziert. Sieben etablierte Zelllinien des Pankreaskarzinoms (BXPC-3; COLO 357; PATU8988-S; PATU8988-T; CAPAN-1; MIA-PaCa-2; PANC-1) wurden mit Hilfe einer Annexin-V/DAPI-Färbung auf eine 5FU- oder Gemcitabin-induzierte Apoptose untersucht. Vier Zelllinien mit einer intrinsischen Sensitivität (BXPC-3; COLO 357; PATU8988-S; PATU8988-T) konnten identifiziert werden. Es folgte die Etablierung einer sekundären Chemotherapie-Resistenz in diesen sensitiven Zelllinien und die Bestätigung durch einen Proliferationsassay. Um die Hypothese einer veränderten microRNA-Expression in den sekundär resistenten Zelllinien zu untermauern, wurde die Expression der microRNAs miR-21, miR-200b und miR-214 untersucht. Eine veränderte Expression wurde gefunden und eine microRNA-Transkriptom-Analyse folgte. Diese deckte eine aberrante Expression von neun microRNAs (miR-7-5p; miR-23a-3p; miR-24-3p; miR-100-5p; miR-125b- 5p; miR-301a- 3p; miR-3158-5p; miR-3621; miR-3940- 5p) auf. Die Validierung dieser microRNAs via RTPCR zeigte eine Überexpression von miR-100 und miR-125b in allen resistenten Tumorzellen. Dies ist die erste Studie, welche valide Beweise für die Beteiligung beider microRNAs an der erworbenen Resistenz gegen 5FU und Gemcitabin zeigt. Für die Evaluation ihrer biologischen Rolle wurde die miR-100 oder miR-125b durch eine transiente Transfektion in den resistenten Zellen inhibiert. Eine Einschränkung der Viabilität und ein Anstieg der Caspasen 3 und 7 konnte nach Applikation der Zytostatika gesehen werden. Durch einen Proliferationsassay konnte eine langfristige Inhibition des Tumorzellwachstums, des Metabolismus und der Viabilität nach dem Knock-down der microRNAs bewiesen werden. Ein Zytotoxizitäts-Assay zeigte, dass die microRNA-Inhibition zu einer Wiederherstellung von Sensitivität und Dosis-Wirkungs-Beziehung gegenüber 5FU oder Gemcitabin führt. Es ist somit gezeigt, dass die miR-100 und miR-125b eine entscheidende Rolle in der Ausbildung einer sekundären Antimetabolit-Resistenz spielen. Ob diese microRNAs als Zielmolekül einer zukünftigen Antitumortherapie oder als Screeningparameter genutzt werden können, müssen weitere Studien zeigen.BACKGROUND: With a 5-year survival rate of only 9% pancreatic cancer ranks on the top of cancer related deaths in Germany. The poor prognosis is often associated with an early chemoresistance to 5FU or gemcitabine. MicroRNAs are small, non-coding RNAs with an important influence on gene regulation and tumour cell biology. This study reveals microRNAs aberrantly regulated in chemoresistant pancreatic cancer to find new strategies for an improved antitumour therapy. MATERIALS AND METHODS: Four pancreatic cancer cell lines (BXPC-3, COLO 357, PATU-S, PATU-T) with an intrinsic sensitivity to 5FU or gemcitabine were propagated with increasing drug concentrations over a period of nine month until an acquired chemoresistance was established. MicroRNA transcriptome analysis was performed. MicroRNAs were transiently inhibited by lipid-based transfection. Cell viability, metabolism, apoptosis or proliferation were measured by spectrophotometric, fluorogenic or luminescent assays. RESULTS: A cell culture model containing eleven cell lines with different grades of chemoresistance was established. MicroRNA expression profiling could highlighted miR-100 and miR-125b overexpressed in all resistant cell lines. Cell function assays revealed a reduced viability, an increased apoptosis and a dose dependent restoration of chemosensitivity in resistant cells after knock-down of miR-100 or miR-125b. CONCLUSION: This is the first study revealing miR-100 and miR-125b as potential new targets of an antitumour therapy against the acquired antimetabolite chemoresistance of pancreatic cancer