Expression, Regulation und Funktion von Arzneistofftransportern in Caco-2-Zellen: ein biorelevantes in vitro-Modell für den intestinalen Arzneimitteltransport?

Die gleichzeitige Gabe von Arzneimitteln kann durch Inhibition oder Induktion von intestinalen Transportproteinen bzw. metabolischen Enzymen unerwünschte Arzneimittelinteraktionen verursachen. Bewirkt wird der induktive Effekt durch die Aktivierung von nukleären Rezeptoren wie PXR. Aktuell sind keine in vitro-Modelle verfügbar, die die Interaktion auf intestinaler Ebene infolge von Induktionsprozessen prognostizieren können. Für intestinale Absorptions- und inhibitorische Arzneistofftransportstudien werden bisher die häufig genutzten Caco-2-Zellen verwendet, da sie enterozytenartige Eigenschaften besitzen. Allerdings gibt es einige Unklarheiten, die das Caco-2-Modell betreffen, wie bspw. der optimale Zeitraum der Zellkultivierung, das fragliche Vorhandensein von nukleären Rezeptoren und die umstrittene Repräsentanz von Colon-Karzinomzellen für den intestinalen, jejunalen Arzneimitteltransport. Ziel dieser Arbeit war es somit, die Eignung der präklinisch genutzten Caco-2-Zellen als in vitro-Modell für Transporter-bedingte Arzneimittelinteraktion und intestinalen Arzneimitteltransport zu untersuchen. Hierzu wurde die Expression klinisch relevanter intestinaler Arzneistofftransporter, Metabolisierungsenzyme und nukleärer Rezeptoren in Caco-2-Zellen auf Gen- und Proteineben mittels real time-RT PCR (TaqMan®-Prinzip) und LC-MS/MS-basiertem targeted proteomics bestimmt und mit der Expression in humanem Jejunum verglichen. Ferner wurde die Expression der erwähnten Determinanten in Abhängigkeit von der Kultivierungszeit und nach Induktion mit den prototypischen Induktoren Carbamazepin, Efavirenz, Hyperforin, Hypericin und Rifampicin untersucht. Zuletzt wurde der Einfluss der Induktoren auf die Funktion des Transporters ABCB1, anhand eines bidirektionalen Transportassays mit den radioaktivmarkierten ABCB1-Substraten [3H]-Digoxin und [3H]-Talinolol, ermittelt. Die Expression der Transporter und nukleären Rezeptoren auf Gen- und Proteinebene in Caco-2-Zellen unterschieden sich deutlich zu der von jejunalem Gewebe. Für die Transporter ABCB1, ABCC2, OATP1A2, OATP2B1, PETP1 und das Enzym UGT1A1 konnte eine signifikante Zunahme der mRNA-Expression mit der Dauer der Kultivierungszeit festgestellt werden, die auf Proteinebene nicht gezeigt werden konnte. Die Induktoren Carbamazepin, Hyperforin, Hypericin und Rifampicin wiesen einen Effekt auf die mRNA-Expression, nicht aber auf die Proteinmenge der Transporter auf. In Übereinstimmung zu den Befunden der fehlenden Transporterinduktion konnte kein Effekt der Induktoren auf die Funktion von ABCB1 beobachtet werden. Caco-2-Zellen sind daher nicht als in vitro-Modell geeignet um Arzneimittel-interaktionen prognostizieren zu können, die durch die Induktion von Transportern entstehen.Induction or inhibition of drug transporting proteins and drug metabolising enzymes by concomitantly administered drugs can cause unwanted drug-drug interactions. The inductive effect is mediated by the activation of nuclear receptors such as PXR. Currently there are no in vitro cell models available which can predict intestinal transporter-mediated drug-drug interactions caused by induction. The Caco-2 cell model is the most widely used in vitro model for drug absorption and inhibitory studies, due to its morphological resemblance to intestinal epithelia. However, there are some drawbacks concerning this cell model, such as the optimal length of cultivation time and the inconsistent information on the expression of nuclear receptors of interest. In addition, there is controversial debate on whether a cell line derived from colonic cancer tissue can be used to determine human jejunal drug absorption. The aim of this dissertation was to investigate the suitability of the Caco-2 cell line as an in vitro model to predict transporter-mediated drug-drug interactions and intestinal drug absorption. The gene expression of clinical relevant intestinal drug transporters, metabolising enzymes and nuclear receptors in Caco-2 cells was determined using real time-RT PCR and LC-MS/MS based targeted proteomics and compared to the gene expression in human jejunal tissue. Furthermore, the transporter expression in Caco-2 cells was investigated as a function of culture time and after incubation with the prototypical inducers carbamazepine, efavirenz, hyperforin, hypericin and rifampicin. Additionally, studies on ABCB1 function were performed using Transwell® assays with [3H]-digoxin and [3H]-talinolol as substrates after incubation with the aforementioned prototypical inducers. The gene and protein expression pattern of drug transporters and nuclear receptors in Caco-2 cells and jejunal tissue differed considerably. The gene expression of the drug transporters ABCB1, ABCC2, OATP1A2, OATP2B1, PEPT1 and the enzyme UGT1A1 showed a significant trend to increase during culture time, which could not be verified at the protein level. The inducers carbamazepine, hyperforin, hypericin and rifampicin presented an effect on the mRNA expression, but not on the protein content of drug transporters. In line with the results of the failing transporter induction, none of the studied prototypical inducers demonstrated an effect on the function of ABCB1. Hence, the Caco-2 cell line is not suitable as an in vitro model to predict drug-drug interactions which are caused by transporter induction