The cellular context of Rabies virus replication - cell culture adaptation, intra-neuronal virus transport and development of host gene targeting vectors

Rabies virus (RABV) is an ancient, highly neurotropic rhabdovirus that causes lethal encephalitis. Most RABV pathogenesis determinants have been identified with laboratory-adapted or attenuated RABVs, but details of natural RABV pathogenesis and attenuation mechanisms are still poorly understood. To provide a deeper insight in the cellular mechanism of pathogenies of field RABV, this work was performed to assess virus strain specific differences in intra-neuronal virus transport, to identify cell culture adaptive mutations in recombinant field viruses and to explore shRNA-expressing RABVs as research tools for targeted host manipulation in infected cells. Comparison of chimeric RABVs with glycoprotein (G) ecto-domains of different lyssaviruses, together with field RABVs from dog and fox in dorsal root ganglion (DRG) neurons revealed no detectable differences in the axonal accumulation of the viruses. This indicates that previously described G-dependent transport of newly formed RABV in axons can occur both in laboratory-adapted and field RABV. Moreover, partial overlap of nucleoprotein (N) and G protein particles in field virus infected DRG axons supported the hypothesis of the “separate model” for anterograde RABV transport. Serial passages of recombinant dog and fox field clones in different cell lines led to the identification of general (D266N) and cell line specific (K444N) adaptive mutations in the G ecto-domain of both viruses. In BHK cells, synergistic effects of D226N, K444N and A417T on field dog virus G protein surface localization led to the loss of endoplasmic reticulum (ER) retention of G and increased virus titers in the supernatant, indicating that limited virus release by ER retention is a major bottleneck in cell culture adaptation. In addition, selection of mutations within the C-terminus of the RABV phosphoprotein (P) (R293H and R293C in fox and dog viruses, respectively) led to the hypothesis of altered binding affinities to nucleoprotein and RNP complexes. Identification of the above mentioned amino acid substitutions together with alterations in a suboptimal transcription stop signal in the P/M gene border indicated that adaptation to cell culture replication occurs on both levels, RNA transcription/replication and virus release. To evaluate the possibility of an expression of a functional microRNA-adapted short-hairpin RNAs (miR-shRNA) expressing RABV, recombinant RABVs encoding miR-shRNAs against cellular Dynein Light Chain 1 (DYNLL1) and Acidic Nuclear Phosphoprotein 32 family member B (ANP32B) were generated. In spite of cytoplasmic transcription of the respective mRNAs, downregulation of DYNLL1 and ANP32B mRNA and respective protein levels in infected cells revealed correct processing to functional shRNAs. Specific downregulation of the cellular genes at 2, 3 and 4 days post infection further demonstrated feasibility of the approach in standard cell lines. However, it remained open whether miR-shRNA expressing RABV can be used to study neuro-infection in vivo. Since first attempts in primary rat neuron cultures failed, it has to be clarified in further experiments whether this strategy can be used in mature, non-dividing neurons or whether breakdown of the nucleus in the course of cell division is a requirement for the processing of cytoplasmically expressed miR-RNA by nuclear RNases. By providing novel insights in axonal RABV transport and cell culture adaptive mutations this work extends the current understanding of RABV pathogenesis in natural and non-natural cell environments. Moreover, it provides a basis for further pathogenicity studies in which the impact of cell culture adaptation through increased virus release on RABV virulence can be investigated. With successful expression of functional miR-shRNAs from RABV vectors, this work also provides a tool for RABV gene targeting in infected cell lines and thus may contribute to the further investigation of RABV-host-cell-interactions.Das Tollwutvirus (RABV) ist ein lange bekanntes, neurotropes Rhabdovirurs, welches tödliche Enzephalitiden auslöst. Obwohl RABV-Pathogenitätsdeterminaten bereits in Experimenten mit laboradaptierten Viren oder attenuierten RABV identifiziert wurden, sind Einzelheiten der natürlichen Pathogenese und Mechanismen der Virusattenuierung kaum verstanden. Um ein besseres Verständnis der zellulären Pathomechanismen von RABV Feldviren zu erlangen, wurde in dieser Arbeit untersucht, inwieweit es Virusstamm-spezifische Unterschiede im intra-neuronalen Transport gibt. Außerdem wurden Zellkultur-adaptive Mutationen identifiziert und es wurde untersucht inwieweit es möglich ist, shRNA-exprimierende RABV als Werkzeug für eine gezielte Wirtszellmanipulation nach Infektion zu nutzen. In Vergleichsstudien mit Feldviren von Fuchs und Hund sowie RABV-Chimären, welche im Glycoprotein (G) die Ektodomänen-Sequenzen von unterschiedlichen Lyssaviren enthielten, konnten keine wesentlichen Unterschiede in der Lokalisation der Viruspartikel in den Axonen dorsaler Spinalwurzelganglien (DRG) festgestellt werden. Somit kann davon ausgegangen werden, dass ein G-abhängiger Transport in DRG-Neuronen Virusstamm-unabhängig erfolgt. Zudem konnte gezeigt werden, dass RABV Nukleoprotein (N) und G Partikel von Feldviren in Axonen von DRG-Neuronen nur teilweise überlagern, was für das „separate transport model“ des anterograden Transports spricht. Sequentielle Passagierung rekombinanter Feldviren von Hund und Fuchs führten zu adaptiven Mutationen im Virusgenom, wodurch allgemeine (D266N) und zelltypspezifische Mutationen (K444N) in den Ektodomänen beider Viren identifiziert werden konnten. Speziell in BHK Zellen konnte für die Mutationen D266N, K444N und A417T im G Protein des Hundevirus ein synergetischer Effekt zur Verbesserung der Oberflächenlokalisation beobachtet werden. Zudem konnte in höheren Passagen weniger G Protein im Endoplasmatischen Retikulum (ER) detektiert sowie höhere Titer erzielt werden. Basierend darauf kann die eingeschränkte Freisetzung von Viruspartikeln auf Grund der Retention im ER als Engpass in der Zellkulturreplikation angesehen werden. Zusätzliche Mutationen im C-Terminus des RABV Phosphoproteins (P) (R293H und R293C jeweils im Fuchs und Hundeisolat) könnten zu angepassten Bindungsaffinitäten von P zum RNP Komplex und somit zu einer angepassten Replikation führen. Die Identifizierung und Charakterisierung der Mutationen, zusammen mit den Anpassungen im Transkriptionsstoppsignal der P/M Gengrenze zeigen, dass eine zellkulturbedingte Anpassung sowohl auf Transkriptions-/ Replikationsebene als auch auf der Ebene der Virusfreisetzung stattfindet. Weiterhin wurde untersuchen, ob eine Expression von mikroRNA-adaptierter short-hairpin RNA (miR-shRNA) durch RABV möglich ist. Dazu wurden rekombinante RABV, welche miRNA-shRNAs gegen die zellulären Gene Dynein Light Chain 1 (DYNLL1) und Acidic Nuclear Phosphoprotein 32 family member B (ANP32B) exprimieren, generiert. Trotz der zytoplasmatischen Transkription der beschriebenen mRNAs zeigte die Herunterregulation von DYNLL1 und ANP32B mRNAs und der dazugehörigen Proteinlevel, dass die exprimierten miR-shRNAs korrekt zu funktionellen shRNAs prozessiert wurden. Durch die gezielte Herunterregulierung von DYNLL1 und ANP32B an Tag zwei, drei und vier nach Infektion konnte zudem bestätigt werden, dass eine Analyse von Virus-Wirt-Interaktionen in Standardzelllinien möglich ist. Es bleibt aber ungeklärt, ob die untersuchte Strategie auch in differenzierten, nicht teilungsfähigen Neuronen angewendet werden kann, da in ersten Experimenten mit Neuronenkulturen von Ratten keine Regulierung der Zielgene durch miR-shRNA exprimierende RABV gezeigt werden konnte. Die zugrundeliegenden Daten zum axonalen RABV Transport sowie zu zellkulturbedingten Adaptionen können dazu beitragen, die Pathogenese von RABV in vivo und in vitro Systemen besser zu verstehen. Auf Basis der vorgestellten Daten können in zukünftigen Pathogenitätsstudien der Einfluss zellkulturbedingter Mutationen auf die Virulenz von RABV untersucht werden. Des Weiteren ist es durch die erfolgreiche Expression von funktionellen miR-shRNAs durch RABV Vektoren möglich über gezielte Genregulation in infizierten Zelllinien Virus-Wirtszell-Interaktionen näher zu untersuchen