Synthese und Charakterisierung potentieller Histon-Demethylase-Inhibitoren

Epigenetische Regulationsmechanismen spielen eine wichtige Rolle bei der Steuerung des Gleichgewichtes zwischen dem Vorliegen von Eu- und Heterochromatin. Neben Acetylierungsprozessen kommt dabei vor allem Methylierungen von Histonen eine entscheidende Bedeutung zu. Die im Fokus der vorliegenden Dissertation stehenden Demethylierungen können dabei zum einen durch sogenannte Lysin-spezifische und zum anderen durch JumonjiC-Domäne enthaltende Histon-Demethylasen katalysiert werden. Bei der zweiten Gruppe handelt es sich um Fe(II)- sowie 2-Oxoglutarat-abhängige Enzyme, welche unter anderem die Oxidoreduktase KDM4A umfassen. In gesundem Gewebe übernimmt diese wichtige Aufgaben im Rahmen der Regulierung des Zellzyklus und der -differenzierung, während daneben jedoch eine Überexpression in diversen Tumorzellarten, wie z. B. Prostata-, Brust- oder Lungenkrebs detektiert wurde. Aus diesem Grund bestand das Ziel jener Arbeit in der Auffindung eines potentiellen KDM4A-Inhibitors in Anlehnung an literaturbekannte Hemmstoffe wie Daminozid oder N-Oxalylglycin, welcher im Folgenden als Leitstruktur für die Erstellung einer Substanzbibliothek dienen sollte. Diese Aufgabe konnte durch die Synthese von drei Tetrazolylcarbonsäurehydraziden erfüllt werden, welche zu einer Inhibition von KDM4A mit IC50-Werten im zweistelligen mikromolaren Bereich in der Lage waren. Die kürzeste dieser drei Verbindungen, 2-(1H-Tetrazol-5-yl)essigsäurehydrazid, wurde aufgrund des kleinsten IC50-Wertes als Leitstruktur für folgende Derivatisierungen ausgewählt. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass es sich bei dieser fragmentartigen Verbindung um einen kompetitiven Inhibitor handelt, welcher zudem eine gewisse Subtypselektivität für KDM4A aufweist. Durch die Synthese und Charakterisierung des am Tetrazolring methylierten Derivates sowie des korrespondierenden Esters wurde die Notwendigkeit des Vorhandenseins eines Komplexbildners in definiertem Abstand zu einer sauren Funktion für eine Hemmwirkung gegenüber KDM4A belegt. Aufgrund der in der Literatur beschriebenen komplexbildenden Eigenschaften von Acylhydrazonen wurde ausgehend von den drei Tetrazolylcarbonsäurehydraziden durch Umsetzung mit verschiedenen Aldehyden und Ketonen eine Substanzbibliothek bestehend aus 46 Verbindungen synthetisiert. Neben der Hydrazonbildung konnte die Leitstruktur durch das Einfügen von α-C-C- und α-C-N-verknüpften Seitenketten derivatisiert werden. Dadurch wurden insgesamt 14 Endverbindungen synthetisiert, wobei die beiden potentesten Substanzen, bei denen es sich um amidhaltige Strukturen handelt, IC50-Werte im Bereich der Leitstruktur aufweisen. Des Weiteren war eine Abwandlung der Leitstruktur infolge des Ersatzes der Methylengruppe durch einen Benzenring möglich. Die biologische Testung der Substanzen erfolgte mithilfe von zwei verschiedenen Assays: Zum einen dem enzymgekoppelten Formaldehyd-Dehydrogenase- und zum anderen dem Antikörper-basierten LANCE-Assay. Des Weiteren wurden im Helmholtz-Zentrum Berlin zehn ausgewählte Verbindungen zusammen mit der zu KDM4A weitestgehend homologen KDM4D kristallisiert und röntgenkristallographisch vermessen. Durch Aufklärung der Bindungsmodi konnte die Grundlage für ein rationales Ligandendesign hinsichtlich der gezielten Synthese weiterer potentieller KDM4x-Inhibitoren gelegt werden. Eine Auswahl von 88 Substanzen der synthetisierten Verbindungen wurde in der Screening Unit des FMP (Leibniz-Forschungsinstitut für Molekulare Pharmakologie) in Berlin, welches Teil des EU-Openscreen-Netzwerkes ist, eingelagert und steht damit für Testungen gegen weitere Targets zur Verfügung. Da die betreffenden Substanzen in Arzneistoffen unterrepräsentierte Strukturen, wie z. B. Hydrazide und aliphatisch gebundene Tetrazole beinhalten, könnten dadurch interessante neue Leitstrukturen für andere Forschungsprojekte identifiziert werden. Ein Teil der Ergebnisse der vorliegenden Dissertation wurde in zwei Publikationen veröffentlicht.Epigenetic regulation mechanisms play a pivotal role in coordinating the equilibrium between euchromatin and heterochromatin. Beside acetylation processes, in particular the methylation of histones is of crucial importance. This dissertation focuses on demethylation reactions that may be catalysed either by so-called lysine-specific demethylases or JumonjiC domain-containing histone demethylases. The latter family consists of Fe(II)- and α-ketoglutarate-dependent enzymes including, amongst others, oxidoreductase KDM4A. In healthy tissue it is involved in important pathways of cell differentiation and the cell cycle, while its overexpression is associated with tumours of prostate, breast and lung. Taking the above relationship as a starting point, the present work focused on the discovery of a potential KDM4A inhibitor in analogy to already published compounds like daminozide and N-oxalylglycine, thus providing a lead for establishing a compound library. This task was fulfilled by the synthesis of three tetrazolyl acylhydrazines, which inhibited KDM4A with IC50 values in the two-digit micromolar range. The shortest of them, 2-(1H-5-tetrazolyl)acetohydrazide, was selected as a lead for further derivatisation due to the lowest IC50. It could be shown that this fragment-like lead acted as a competitive inhibitor with relative subtype selectivity for KDM4A. By preparation and characterisation of the corresponding ester as well as of a derivative methylated on the tetrazole ring, a complexing moiety and an acidic function in a certain distance were demonstrated to be essential structural requirements for inhibiting KDM4A. Based on the complexing properties of acylhydrazones described in the literature, a library consisting of 46 compounds was prepared by reaction of the three tetrazolyl acylhydrazines with diverse aldehydes and ketones. Furthermore, the lead structure was derivatised by introducing α-C-C and α-C-N-connected sidechains. Thus, 14 potential inhibitors were obtained with the two most potent bearing amide-containing sidechains and exhibiting IC50 on par with the lead. In addition, the modification of the lead where the methylene group is replaced by a benzene ring could be realised. Biological characterisation of the prepared inhibitors was performed using two assays: On the one hand with the enzyme-coupled formaldehyde dehydrogenase assay, on the other hand with the antibody-based LANCE assay. Also, ten selected derivatives were co-crystallised in presence of KDM4D at the Helmholtz-Zentrum, Berlin, eventually resolving their structure by X-ray crystallography. This isoenzyme shows high homology towards KDM4A. By elucidation of the binding modes, the base for a rational ligand design could be set with regard to the targeted synthesis of even more potent KDM4x inhibitors. A selection of 88 derivatives was stocked at the Screening Unit of FMP (Leibniz-Forschungsinstitut für Molekulare Pharmakologie), Berlin, which is part of the EU Openscreen Network. Hence, these derivatives were made available for screening against other targets. Since the stocked library contains moieties underrepresented in drugs, such as hydrazides and alkyl tetrazoles, new leads for other research fields may thus be identified. Parts of the present dissertation were disclosed in two publications