Die Bedeutung der RhoA-Rho-Kinase und der NADPH-Oxidase für die Tonusregulation renaler Widerstandsarterien hypertensiver Cyp1a1ren-2- transgener Ratten

Die Nieren spielen in der Regulation des Blutdrucks eine sehr wichtige Rolle, da sie den Wasser- und Elektrolythaushalt kontrollieren und Schwankungen des Blutdrucks langfristig normalisieren können. Bei der Entwicklung einer arteriellen Hypertonie wird häufig eine Funktionsstörung der Nieren beobachtet, insbesondere eine Erhöhung des renalen Gefäßwiderstands. Die entsprechenden pathophysiologischen Prozesse sind noch nicht vollständig geklärt. Die Enzyme Rho-Kinase (ROCK) und NADPH-Oxidase (NOX) sind an vielen physiologischen Steuerungsprozessen des Organismus beteiligt, vor allem auch an der Regulation des Gefäßtonus. Sie wurden in mehreren experimentellen und klinischen Studien mit der Entstehung einer arteriellen Hypertonie in Verbindung gebracht. Ziel der vorliegenden Arbeit war es zu klären, inwiefern ROCK und NOX in der Entwicklung einer arteriellen Hypertonie auf die Erhöhung des renalen Gefäßwiderstands Einfluss nehmen. Die Untersuchungen wurden am Tiermodell der Cyp1a1ren-2 transgenen Ratten durchgeführt, das es ermöglicht, durch Beigabe des Stoffes Indol-3-Carbinol zum Futter, eine AngII-abhängige Hypertonie zu induzieren. Die Tiere wurden in Gruppen mit unterschiedlich langer Induktionsphase und Induktionsdosis aufgeteilt, wodurch verschiedene Phasen der Hypertonieentwicklung beobachtet werden konnten. Anschließend wurden mit Nierengefäßen und Aortengewebe der Versuchstiere mehrere Experimente zur Aktivität der ROCK und NOX und deren Einfluss auf die Gefäßkontraktilität durchgeführt. In den Nierengefäßen der induzierten Tiere konnte mittels PCR eine erhöhte Gen-Expression der NOX-Isoformen Nox1 und Nox2 nachgewiesen werden. Die Lucigenin verstärkte Chemilumineszenz ergab zudem Hinweise auf eine vermehrte NOX abhängige Superoxidbildung in den Nierengefäßen der hypertonen Tiere. Die Gen-Expression der ROCK-Isoformen war nach Induktion eines Bluthochdrucks nicht signifikant unterschiedlich. Auch die Aktivität der ROCK, die durch Western-Blot Versuche ermittelt wurde, zeigte keine Unterschiede. Zusätzlich wurde in einem Drahtmyographen die Gefäßantwort auf Phenylephrin ohne und mit Zugabe des ROCK-Inhibitors Y-27632 sowie ohne und mit Zugabe des Superoxid Radikalfängers Tiron gemessen. Auch wurde in einem Experiment die Gefäßantwort auf H2O2 untersucht. Diese Experimente ließen den Schluss zu, dass die ROCK bei den induzierten Tieren eine zunehmende Bedeutung in der Phenylephrin-induzierten Gefäßkontraktion renaler Widerstandsgefäße hatte, wohingegen radikale Sauerstoffspezies keinen veränderten Einfluss nach Induktion der Hypertonie zeigten. Im Rahmen dieser Arbeit war es zudem möglich, diese Untersuchungen zur Gefäßkontraktilität auch an humanen renalen Gefäßen durchzuführen, die nach Tumor bedingter Explantation aus einer Niere gewonnen wurden. Hierbei zeigte sich durch die ROCK-Hemmung auch eine signifikante Verringerung der Agonist-induzierten Kontraktion menschlicher Nierengefäße. Dies mag auf eine Übertragbarkeit der tierexperimentellen Ergebnisse auf die Vorgänge in der menschlichen Niere hinweisen. Zusammenfassend haben die Untersuchungen gezeigt, dass ROCK und NOX in unterschiedlicher Form einen Einfluss auf den renalen Gefäßwiderstand in der frühen Hypertonieentwicklung Cyp1a1ren-2 transgener Ratten haben. Dabei können auch Wechselwirkungen zwischen den Enzymen eine Rolle spielen, da mehrere andere Studien eine gegenseitige Aktivierung der ROCK und NOX beobachteten. Die vorliegende Arbeit unterstreicht die Bedeutung der Untersuchung der ROCK und NOX und ihrer Hemmstoffe mit dem Ziel der Entwicklung potenzieller neuer Medikamente, um die Therapie der Hypertonie weiter verbessern zu können.The kidneys play an important role in the regulation of the blood pressure. A normal renal function controls the water and electrolyte balance and contributes to the maintenance of an optimal blood pressure. The development of arterial hypertension is often associated with an impaired renal function such as an elevated renal vascular resistance. The underlying pathophysiological processes await further elucidation. A number of experimental and clinical studies on hypertension development propose a significant role of both, the Rho-kinase (ROCK) and the NADPH oxidase (NOX) since they are involved in the regulation of several relevant biological processes including the stabilization of the vascular tone. The purpose of the present study was to examine if and in what way ROCK and NOX influence the renal vascular resistance while the hypertension arises. The experiments were performed in an established animal model. In Cyp1a1-ren2 transgenic rats an angiotensin II-dependent hypertension is induced by adding indole-3-carbinol to the diet. By dividing the animals into groups with different induction periods as well as different induction doses, it was possible to investigate various stages during the development of hypertension. In experiments with kidney vessels and aortic tissue of the test animals, the activities of ROCK and NOX and their influence on the vascular contractility were explored. An elevated gene expression of the NOX isoforms NOX1 and NOX 2 was demonstrated in the kidney vessels. In addition, the lucigenin-enhanced chemiluminescence proposed an increased NOX-dependent generation of superoxides in the renal vessels of the hypertensive animals. In contrast, the gene expression of the ROCK isoforms was not elevated. Likewise, the enzymatic activity of ROCK measured by Western blot tests did not show any modification due to the induction of hypertension. Furthermore, the influence of phenylephrine on the vascular reaction was investigated in a wire myograph with and without addition of the ROCK inhibitor Y-27632 as well as with and without the radical scavenger tiron. The same experimental setting was used to explore a potential reaction of the vessels to hydrogen peroxide. These experiments allowed the conclusion that ROCK indeed played a role in the phenylephrine-induced contraction of the renal vessels in the hypertensive animals whereas this did not apply to the oxygen species. We expanded the investigation of the vascular contractility on human renal tissue that was harvested from kidney explantation material. A significant decrease of the agonist induced contractility of the kidney vessels under ROCK inhibition was shown. Hence, the results of the animal experiments may allow to draw conclusions for the processes in the human kidney. In summary, the present study has demonstrated different influences of ROCK and NOX on the renal vascular resistance in the early development of hypertension in Cyp1a1-ren2 transgenic rats. Interactions of the enzymatic systems may play a role as shown in other investigations. Our results emphasise the experimental relevance of ROCK and NOX and their inhibitors for the development of new drug substances in order to further improve the treatment of arterial hypertension