Molekulare Analyse des Kernfreisetzungskomplexes des Pseudorabies Virus

Herpesviren nutzen einen Vesikel-vermittelten Transportweg für die Translokation von Nukleokapsiden aus dem Zellkern, um für die weitere Virusmorphogenese in das Zytoplasma zu gelangen. Den dafür notwendigen Kernfreisetzungskomplex (nuclear egress complex; NEC) bilden zwei konservierte herpesvirale Proteine, die als pUL34 und pUL31 bezeichnet werden. Die Kristallstrukturen der NECs aus verschiedenen Herpesviren zeigten eine stabile Interaktion zwischen der N-terminalen Domäne von pUL31 und dem Kern von pUL34. Darüber hinaus gehören die am stärksten konservierten Reste von pUL31 zu einem Zinkfinger-Motiv (ZNF). Zur Klärung der funktionellen Bedeutung des ZNF-Motivs in PrV pUL31, das aus drei Cysteinen (C73, C89 und C92) der CR1 und einem Histidin (H188) der CR3 besteht, wurden die Cysteine einzeln zu Serinresten und das Histidin H188 zu Alanin substituiert. Funktionelle Analysen der mutierten Proteine, die in vitro mit artifiziellen Membranen und in situ in eukaryotischen Zellen durchgeführt wurden, zeigten, dass das ZNF-Motiv eine wesentliche Voraussetzung für die NEC-Bildung und die notwendige Membranveränderung darstellt. Der N-terminale Bereich von pUL31 und der anderen Homologen ist sehr variabel und wurde daher in den Konstrukten für die Kristallisierung weggelassen. Wie auch einige andere pUL31-Homologe enthält PrV pUL31 ein Kernlokalisationssignal (NLS) im N-Terminus für einen effizienten Kernimport. Neben der Funktionalität des Kernimports scheint dieser spezifische Bereich ebenfalls eine Rolle bei der Freisetzung von Nukleokapsiden aus dem Kernspalt, der Vorbeugung von einer vorzeitigen Komplexbildung im Zytoplasma, der Translokation der reifen Kapside an die INM und bei der Regulierung des envelopment/deenvelopment Prozesses über Phosphorylierung zu spielen. Um zu untersuchen welche zusätzlichen Funktionen der N-terminale Bereich einnimmt, wurde der N-Terminus von PrV pUL31 schrittweise verkürzt. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Aminosäuren 2-13 (pUL31-N14), einschließlich des Hauptteils des vorhergesagten NLS, für die NEC-Bildung und -Funktion entbehrlich sind. Die Deletion von vier zusätzlichen Aminosäuren (pUL31-N18), die alle grundlegenden Patches eliminierte, führte jedoch zu einem defekten Protein. Die vollständige Deletion der 25 N-terminalen Aminosäuren zeigte in Gegenwart von Wildtyp pUL31 eine Inhibierung des Kernaustritts. pUL31-N18, was überwiegend im Zytoplasma gefunden wurde, zeigte keinen dominant-negativen Effekt. Die Phosphorylierung der beiden vorhergesagten Stellen im N-Terminus von PrV pUL31 (S12/S13) spielt offensichtlich keine Rolle beim Kernaustritt. Die Titer von PrV-Mutanten denen pUL34 oder pUL31 fehlt, werden drastisch reduziert, jedoch die Freisetzung infektiöser Nachkommen nicht komplett inhibiert, was auf einen alternativen Austrittsweg hinweist. Wiederholtes Passagieren dieser Mutanten führte zu Revertanten, die eine Wildtyp-ähnliche Replikation wiedererlangten. PrV-ΔUL34Pass und PrV-ΔUL31Pass umgingen dabei den vesikulären Transportweg durch das Induzieren einer Fragmentierung der Zellkernmembran (NEBD). Um zu testen, ob CDKs eine Rolle im viral induzierten NEBD spielen, wurden Wildtyp- (wt) oder dominant-negative (DN) Versionen der zellulären CDKs 1-6 getestet. In Gegenwart von CDK2DN wurden die Titer für beide Viren signifikant reduziert. Ultrastrukturelle Analysen zeigten, dass die Freisetzung von PrV-Ka primären Virionen aus dem perinukleären Raum beeinträchtigt oder verzögert war und NEBD nur selten in PrV-ΔUL34Pass-ΔgG-CDK2DN-infizierten Zellen beobachtet wurde. Die genaue Zusammensetzung der primären Virionen sowie der Maschinerie für die Verschmelzung der primären Hülle mit der äußeren Kernmembran sind nicht bekannt. Um virale und/oder zelluläre Proteine und andere primäre Virion-Komponenten zu identifizieren, sollen primär umhüllte Virionen aus dem perinukleären Raum isoliert und durch Massenspektrometrie analysiert werden. Da die Reinigung der primären Virionen aus dem perinukleären Raum nicht ganz einfach ist, wurde das membranverankerte pUL34 mit verschiedenen Affinitätsmarken markiert. Vier markierte pUL34-Konstrukte wurden nach Transfektion und Infektion generiert und getestet. Drei von ihnen erwiesen sich als funktionell während des herpesviralen Kernaustritts und es konnten stabil exprimierende Zelllinien hergestellt werden. Diese Zelllinien bilden nun eine solide Grundlage für weitere Experimente, um zuverlässige Protokolle für die Reinigung von primären Virionen aus dem perinukleären Raum zu etablieren.Herpesviruses use a vesicle-mediated transport for translocation of nucleocapsids from the nucleus to the cytoplasm for final virus maturation. Two conserved herpesviral proteins, designated as pUL34 and pUL31, form the nuclear egress complex, which is required for efficient nuclear egress. The crystal structures of NECs from different herpesviruses showed a tight interaction of the N-terminal domain of pUL31 forming a hook-like extension clamping the core of pUL34. Furthermore the most conserved residues of pUL31 belong to a zinc finger motif (ZNF). To clarify the functional importance of the ZNF motif in PrV pUL31, which consists of three cysteines (C73, C89 and C92) contributed by the CR1 and a histidine (H188) from CR3, cysteines were individually substituted by serine residues, and the histidine H188 was replaced by an alanine. Functional analyses of the mutant proteins performed in vitro with artificial membranes and in situ in eukaryotic cells showed that the ZNF motif is an essential prerequisite for NEC formation and the membrane remodeling activity. The N-Terminus of the pUL31 homologs is variable and highly flexible and was therefore omitted in the constructs used for crystallization. Like several other pUL31 homologs PrV pUL31 contains a nuclear localization signal (NLS) in the N-terminus for efficient nuclear targeting. In addition to being a transport signal other functions have been suggested for this part, as preventing premature complex formation in the cytoplasm, translocation of the mature capsids to the INM and regulation of the envelopment/deenvelopment process via phosphorylation. To test for additional functions, the N-terminal part of PrV pUL31 was sequentially truncated. Thereby, it could be shown that amino acids 2-13 (pUL31-N14), including the major part of the predicted NLS, are dispensable for NEC formation and function. However, deletion of four additional amino acids (pUL31-N18), which eliminates all basic patches, resulted in a nonfunctional protein. Complete deletion of the 25 N-terminal amino acids previously showed inhibition of nuclear egress also in presence of wild-type pUL31. pUL31-N18, despite being found predominantly in the cytoplasm, showed no dominant-negative effect. Phosphorylation of the two predicted sites in the PrV pUL31 N-terminus (S12/S13), apparently does not play a role during nuclear egress since pUL31-N14 lacking these two sites efficiently complemented the defect of PrV-∆UL31. Titers of PrV mutants lacking pUL34 or pUL31 are drastically reduced but infectious progeny is still produced in a very limited amount pointing to alternative egress pathways. Extensive passaging of these mutants resulted in revertants which regained wild-type like replication. These mutants, PrV-∆UL34Pass and PrV-∆UL31Pass bypassed the vesicular transport pathway by inducing nuclear envelope breakdown (NEBD). To test whether CDKs play a role in the virally induced NEBD, wild-type (wt) or dominant-negative (DN) versions of cellular CDKs 1 to 6 were tested. In the presence of CDK2DN virus titers were significantly reduced for both viruses. Ultrastructural analysis showed that release of PrV-Ka primary virions from the perinuclear space was impaired or delayed and NEBD was rarely observed in PrV-∆UL34Pass-∆gG-CDK2DN infected cells. The exact composition of primary virions is not known as is the machinery which determines fusion of the primary envelope with the outer nuclear membrane. To identify viral and/or cellular proteins and other primary virion components, primary enveloped virions should be isolated from the perinuclear space and analyzed by mass spectrometry. Since purification of the primary virions from the perinuclear space is not trivial, the membrane-anchored pUL34 was tagged with different affinity-tags. Four tagged pUL34 constructs were generated and tested after transfection and in infection. Three of them proved to be functional during herpesvirus nuclear egress and stably expressing cell lines were generated. These cell lines now build the solid basis for further experiments to establish reliable protocols for purification of primary virions from the perinuclear cleft