Untersuchungen zu bekannten und neuartigen Inhibitoren der Glutathionperoxidase: Charakterisierung der Enzyminhibition durch Mercaptobernsteinsäure, Tiopronin und Pentathiepine sowie deren zellbiologischen Eigenschaften in Tumorzellen

In der vorliegenden Arbeit sollen bekannte und neuartige Inhibitoren der Glutathionperoxidasen sowohl in ihrer Eigenschaft als Inhibitor, als auch deren Effekte in Tumorzellen näher charakterisiert werden. Dabei standen zu Beginn die Mercaptobernsteinsäure sowie Tiopronin besonders im Fokus. Es konnte gezeigt werden, dass beide Substanzen effektiv bovine Glutathionperoxidase inhibieren, wobei die Effektivität sowohl in IC50-Werten als auch in Inhibitionskonstanten (Ki) ausgedrückt werden konnten. Durch Adaption des GPx-Assays auf humane GPx-Aktivität konnte ebenfalls gezeigt werden, dass Mercaptobernsteinsäure in der Lage ist, humane GPx-Aktivität zu reduzieren, allerdings nicht Tiopronin. Kombinationen von Mercaptobernsteinsäure mit Wasserstoffperoxid auf Tumorzellen zeigten erhöhte Akkumulationen reaktiver Sauerstoffspezies in Relation zu Zellen, die nur mit Wasserstoffperoxid inkubiert wurden. Die Glutathionperoxidase könnte in zellulären Systemen durch Mercaptobernsteinsäure gehemmt sein. Entsprechende Kombinationen mit Tiopronin zeigten den gegenteiligen Effekt, Tiopronin scheint als Antioxidans zu fungieren. Auch Kombinationen von Tiopronin mit Cisplatin, Doxorubicin und Methotrexat zeigten teilweise Wirkungsverluste der Zytostatika. Weiterführend wurde im Rahmen der Arbeit eine neue Klasse von Inhibitoren der Glutathionperoxidase identifiziert, die Pentathiepine. Durch unterschiedliche heteroaromatische Grundkörper sowie verschiedenen Substituenten konnten interessante Struktur-Wirkungsbeziehungen detektiert werden. Bei der Charakterisierung der inhibitorischen Aktivität gegenüber der Glutathionperoxidase stellte sich heraus, dass es sich offenbar um irreversible- sowie kompetitive Inhibitoren handelt. Die inhibitorischen Eigenschaften sind dabei in Bezug auf inhibitorische Potenz sowie Selektivität aller bisher bekannten Inhibitoren überlegen. Pentathiepine zeigen aber auch auf zellulärer Ebene interessante Eigenschaften, da sie in einer Vielzahl verschiedener Tumorzellen viabilitäts- bzw. proliferationsinhibierende Eigenschaften besitzen, mit IC50-Konzentrationen im unteren mikromolar-Bereich. Korrelationsanalysen zeigten, dass offenbar die Proliferationsinhibition der Pentathiepine mit der inhibitorischen Aktivität gegenüber der Glutathionperoxidase einhergeht. Weiterführend konnte gezeigt werden, dass Pentathiepine massiv reaktive Sauerstoffspezies in den Zellen induzieren und Apoptose auslösen. Die Apoptose-Einleitung wurde durch Annexin-V/Propidiumiodid-Markierung, Detektion von PARP-Spaltprodukten sowie durch die Bestimmung der Mitochondrien-Funktionalität durch Visualisierung des mitochondrialen Membranpotentials bestätigt. Zusammenfassend scheint eine Apoptoseauslösung über den intrinsischen Signalweg vorzuliegen. Durch die Zelllinie HAP-1 sowie deren Glutathionperoxidase-1 ausgeknockten Variante konnten Zytostatika identifiziert werden, auf die knockout-Zellen besonders sensitiv reagieren. Zu diesen gehören Cisplatin-Analoga, Lomustin und Temozolomid. In Kombinationsuntersuchungen mit diesen Zytostatika konnte gezeigt werden, dass für die Kombination von Cisplatin mit Pentathiepinen kein positiver Effekt resultiert. Die Zytotoxizität von Cisplatin wurde dabei in verschiedenen Tumorzellen durch die gleichzeitige Inkubation mit Pentathiepinen abgeschwächt. Kombinationen von Lomustin bzw. Temozolomid mit Pentathiepinen und Mercaptobernsteinsäure führten zu signifikanten Wirkverstärkungen in den untersuchten Zelllinien. Zusammenfassend lässt sich verfassen, dass die neuen Glutathionperoxidase-Inhibitoren ein nützliches Werkzeug zur Aufklärung biologischer Prozesse in Tumorzellen in Bezug auf den Umgang mit oxidativem Stress darstellen können. Gezeigt wurde, dass die kombinatorische Gabe von Inhibitoren der Glutathionperoxidase mit verschiedenen Tumortherapeutika durch eine verstärkte Toxizität aussichtsreich erscheint und in Hinblick auf die häufig sehr schlechten Prognosen verschiedener Tumorerkrankungen, die Tumortherapie durch Zusatz von Pentathiepinen verbessert werden könnte.The topic of this dissertation was to better characterize known inhibitors of the glutathione peroxidase as well as identify novel compounds that can inhibit the enzyme and to characterize their biological effects in various cancer cell lines. Beginning with the well-known inhibitors mercaptosuccinic acid and tiopronin, data is presented for the inhibition of the bovine enzyme in terms of IC50-values and inhibition constants (Ki). After modification of the glutathione peroxidase assay to detect activity of glutathione peroxidase in lysates of human cancer cells, we found that mercaptosuccic acid but not tiopronin was able to inhibit human enzyme activity. In cancer cells the combination of mercaptosuccic acid with hydrogen peroxide resulted in a greater accumulation of reactive oxygen species compared to cells incubated with just hydrogen peroxide. That led to the presumption that mercaptosuccinic acid acts to inhibit the glutathione peroxidase in cells, thus decreasing its destruction. In contrast, these same experiments with tiopronin showed the opposite effect, indicating that the thiol compound acts instead as an antioxidant. In support of this hypothesis, combinations of tiopronin with cisplatin, doxorubicine and methotrexate resulted in an attenuated cytostatic activity of the anticancer drugs. A highlight of this work was the discovery of a novel class of inhibitors of the glutathione peroxidase, the pentathiepins. These compounds, possessing varying heteroaromatic structures and various substituents showed interesting structure-activity relationships. The mode of inhibition appears to be irreversible and competitive. These investigations showed that pentathiepins have a greater enzyme inhibiting potency and selectivity compared to all previously known inhibitors. In addition, in cellular systems pentathiepins showing interesting biological activities. In a broad range of human cancer cell lines we were able to detect IC50-values for inactivation of the viability and inhibition of proliferation in low micro molar concentrations. Statistical correlation analysis between potency of cell growth inhibition (IC50) and potency towards enzyme inhibition (IC50) of the bovine enzyme, a significant correlation between these two properties was observed. In addition, pentathiepins cause a large burst of reactive oxygen species in cancer cells. Pentathipins also induced apoptotic death in cells, evidenced by the Annexin-V/propidium iodide assay, the detection of PARP-cleavage and loss of mitochondria polarization. With the human leukemia cell line HAP-1 and its glutathione peroxidase knockdown variant, different cytotoxic potencies were identified for several anticancer drugs, namely: cisplatin, lomustine and temozolomide. In combination with cisplatin, the inhibitors of the glutathione peroxidase were found to attenuated the potency of cisplatin in different cancer cell lines. On the other hand, lomustine or temozolomide combined with either pentathiepins or mercaptosuccinic acid, combination results in significant increases in cytotoxic potency in various cancer cell lines. In summary these results show that the new inhibitors of the glutathione peroxidase can be a useful tools for better understanding of biological processes in case of cancer cells and their handling with oxidative stress. Combinations of glutathione peroxidase inhibitors with different anticancer agents results in a greater potency of some of the drugs but not for others. Due to the often poor prognosis of cancer, combination of pentathiepins to the chemotherapy might improve the outcome of some treatment regimes