Intrazelluläres Überleben von Staphylococcus aureus in Makrophagen

Im Rahmen vorliegender Dissertation wurde das intrazelluläre Überleben von S. aureus in Makrophagen charakterisiert. Dabei lag ein Schwerpunkt auf der Verwendung von primären murinen Knochenmarkmakrophagen, deren Interaktion mit S. aureus bisher wenig beschrieben ist. Die Internalisierung und Persistenz von S. aureus in primären Makrophagen könnte dabei als Pathogenitätsmechanismus für die therapieresistenten und persistierenden, sowie rekurrenten Infektionen relevant sein, die der Erreger neben den klassischen Manifestationen einer S. aureus-Infektion hervorruft. In diesem Zusammenhang sollte auch diskutiert werden, ob es sich bei S. aureus um ein typisches fakultativ intrazelluläres Bakterium handelt. Zunächst wurde anhand eines in-vitro-Infektionsmodells gezeigt, dass verschiedene S. aureus–Stämme in einer murinen Makrophagen-Zelllinie, sowie in primären murinen Knochenmark-Makrophagen mindestens 5 Tage unter langsamer Reduktion der anfänglichen Keimzahl überleben können. Der als Kontrollstamm eingesetzte KNS-Vertreter S. epidermidis ATCC 12228 konnte etwa 3 Tage intrazellulär nachgewiesen werden. Die gleichen S. aureus-Stämme wurden bezüglich ihrer Internalisierungsrate untersucht. Dabei zeigte sich, dass die S. aureus-Stämme Newman und RN 6390 im Vergleich zu den S. aureus ATCC-Stämmen 25923, 12600 und 29213 deutlich geringer internalisiert wurden. Sogar S. epidermidis ATCC 12228 wies ihnen gegenüber eine höhere Phagozytoserate auf. Dies verdeutlicht die Begrenzbarkeit von Studien, in denen unterschiedliche S. aureus-Stämme untersucht werden. Die geringen Internalisierungsraten von Newman und RN 6390 lassen sich dabei aus ihren bekannten regulatorischen bzw. funktionellen Gendefekten erklären. Im Rahmen dieser Arbeit wurde darüber hinaus ein Infektionsmodell entwickelt, in dem Makrophagen von BALB/c- und C57BL/6-Mäusen vergleichend bezüglich Phagozytose und intrazellulärem Überleben von S. aureus untersucht wurden. Anders als uns von in-vivo-Infektionsmodellen mit S. aureus bekannt ist, zeigten sich in-vitro keine Unterschiede in der Eliminationsfähigkeit von primären Knochenmarkmakrophagen von C57BL/6- und BALB/c-Mäusen gegenüber intrazellulärem S. aureus. Die genetisch bedingte unterschiedliche Empfänglichkeit der verschiedenen Mausstämme gegenüber einer S. aureus-Infektion beruht wahrscheinlich nicht auf den unterschiedlichen bakteriziden Mechanismen der Makrophagen. Es erfolgten weiterhin Experimente mit primären Knochenmarkmakrophagen von Mäusen mit Defekten im iNOS Gen bzw. der gp91 Untereinheit der NADPH-Oxidase, um die Makrophagen-spezifischen Abwehrmechanismen gegenüber einer S. aureus-Infektion genauer zu charakterisieren. Dabei konnte kein Effekt von bakteriziden oxidativen, oder nitrosativen Effektormechanismen des Makrophagen auf die Phagozytose, oder das intrazelluläre Überleben von S. aureus festgestellt werden, obwohl S. aureus die NO-Produktion in Makrophagen induzierte. Zur Untersuchung der bakteriellen Regulation in der Interaktion mit Makrophagen wurden schließlich S. aureus-Stämme mit Mutationen in den globalen regulatorischen Systemen agr bzw. sae eingesetzt. Agr und sae sind essentielle Regulatoren der S. aureus-Pathogenitätsfaktoren. In vorliegenden Ergebnissen zeigte sich deren Einfluss vor allem bezüglich der Phagozytoserate. Das intrazelluläre Überleben hingegen wurde nur unwesentlich beeinflusst. Während sae sich als entscheidend für die Internalisierung erwies, zeigte agr einen gegensätzlichen Effekt. Agr zeigte sich hingegen verantwortlich für die initiale, kurzzeitige Proliferation von S. aureus in Makrophagen. Weiterhin stellten sich das S. aureus-Oberflächenprotein FnBPA, als auch das extrazelluläre Matrixprotein Fibronektin für die Internalisierung in primäre Makrophagen als essentiell heraus. Diese Ergebnisse zeigten, dass die intrazelluläre Aufnahme von S. aureus in Makrophagen durch verschiedene bakterielle Komponenten stark beein flusst wird.The internalisation and persistence of S. aureus inside macrophages could be one possible reason for the long-lasting, recurring and antibiotica-resistent infections of this common bacterium. Therefore the aim of our work was to characterize the intracellular survival of S. aureus in macrophages therebye using an in vitro-infection model with different S. aureus strains and murine bone-marrow-derived macrophages which was to our knowledge the first time to have this host-cell-system to describe the interaction of S. aureus with macrophages. We could show that S. aureus can persist over 5 days inside the host cells with an early proliferation up to 24 hours and than a slow reduction of the intracellular bacterial load (CFU). This kinetic was similar in all used S. aureus-Strains (Newman, RN 6390). S. epidermidis in the other hand was seen viable only 3 days. Interestingly the rate of phagocytosis in contrast was dependent on the used strains. We could further show, that there was no difference in the elimination of S. aureus using BMM from BALB/c- und C57BL/6-mice although it is known that BALB/c-mice are less resistent in in-vivo-modells. Macrophages are likely not responsible for the different resistance of these genetically different mice. In experiments with BMM from iNOS- and gp91phox- knockout-mice there was suprisingly seen no effect of these oxidative molecules of macrophages for the elimination of S. aureus althouh the S. aureus-infection provokes significant the NO-Induction. Furthermore we exiamined the role of the agr- and sae-regulator of S. aureus by using mutant-Strains. It could be shown that not the intracellular killing but the internalisation rate was influenced by both regulators. The agr-mutant was internalised much higher whereas the internalisation of the sae-mutant was notably decreased. Also the Fibronectin-binding protein (FnBPA) of S. aureus plays a distinct role in the internalisation by macrophages as well as the extracellular matrix protein Fibronectin itself. For this, our results could show that different bacterial components can influence phagocytosis and survival of S. aureus in macrophages