Die Speicheldrüsenzellen des medizinischen Blutegels, Hirudo verbana - Struktur, Inhaltsstoffe und mögliche Funktionen

Der Speichel des medizinischen Blutegels, H. verbana enthält eine Vielzahl von Proteinen und Peptiden mit deren Hilfe das Tier bei seinen Wirten parasitiert. Die bioaktiven Speichelinhaltsstoffe sind in den einzelligen Speicheldrüsenzellen des Tieres lokalisiert und werden während des Saugaktes über die Ausführgänge einer jeden Zelle in die Bisswunde des Wirtes transferiert. Die Proteine ermöglichen es dem Parasiten das Blut des Wirtes optimal aufzunehmen und es bis zu einem Jahr im Speichermagen zu bevorraten. In den letzten Jahrzehnten wurden einige Speichelproteine identifiziert und rekombinant hergestellt. Aufgrund schmerzstillender, gefäßerweiternder, gerinnungshemmender und vermutlich auch thromobolytischer Eigenschaften sind diese Substanzen in der Humanmedizin und -prophylaxe von potenzieller Bedeutung. Seit Jahrhunderten wird die klassische Blutegeltherapie durch das Ansetzen lebender Egel an die Haut des Menschen von Heilpraktikern und Ärzten erfolgreich durchgeführt. Gleichwohl sind die Funktionen der meisten sekretorischen Speichelproteine weiter ungeklärt und die Mechanismen, die zur Freisetzung der Proteine aus den Vorratsbehältern führen, unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte im Zuge der Quantifizierung der Speichelproteine und -peptide von H. medicinalis und H. verbana festgestellt werden, dass es keine globalen Unterschiede im Expressionsmuster beider Arten gibt. Es ist anzunehmen, dass der ohnehin in den letzten Jahren vermutlich zumeist, wenngleich vom Therapeuten unbewusst, eingesetzte H. verbana ähnliche Speichelproteine wie der tatsächlich medizinisch zugelassene H. medicinalis besitzt. Darüber hinaus wurde in dieser Arbeit mit gelfreien und gelbasierten Methoden erstmals das sekretorische Speichelproteom eines einzelnen Blutegels dargestellt. Dieses wird es zukünftig erlauben, Speichelproteine zu identifizieren und auf deren Funktion zu testen. Mit Hilfe der 3D-Rekonstruktion von Speicheldrüsenzellen konnte ermittelt werden, dass ein adulter Blutegel der Art H. verbana etwa 36.960 Speicheldrüsenzellen mit einem mittleren Volumen von 67.048 ± 38.935 µm³ besitzt. Aus den Daten und dem ermittelten Proteingehalt einer Speicheldrüsenzelle wurde geschlussfolgert, dass ein Blutegel über 1,2 ± 0,7 mg Protein in seinen Speicheldrüsenzellen verfügt. Sollte die gesamte Proteinmenge in den Wirt transferiert werden, könnten individuelle Komponenten des Egelspeichels in einem extrazellulären Verteilungsvolumen von 5 l (Mensch) maximale Konzentrationen zwischen 3 und 236 pmol/l erreichen. Gleichwohl ergaben histologische Studien, die eine Reduktion der Speicheldrüsenzellflächen nach der Nahrungsaufnahme anzeigen und auf eine Entleerung der Speicheldrüsen im Zuge des Saugaktes schließen lassen, dass die Zellflächen in gesogenen Tieren gegenüber den Zellflächen in ungesogen Egel nur um etwa 40 % reduziert sind. Die sich ergebene Frage, ob die Entleerung der Drüsenzellen dementsprechend auch nur anteilig erfolgt, kann derzeit aufgrund nur lückenhafter Erkenntnisse zur inneren Struktur der Speichelsekretionszelle noch nicht beantwortet werden. Mit Verweis auf das einzige pharmakokinetisch umfangreich untersuchte Speichelprotein Hirudin (Ki 2,3 pmol/l) kann jedoch gemutmaßt werden, dass selbst unter der Annahme einer nur 40 %igen Speicheldrüsen-Entleerung die in den Wirt transferierte Menge an individuellen Speichelproteinen eines einzelnen Tieres ausreichend hoch sein könnte, um pharmakologisch wirksame Konzentrationen im Organismus zu erreichen. Interessanterweise gelang es in dieser Arbeit erstmals zu zeigen, dass die Neusynthese der Speichelproteine, obgleich die Tiere von dem Nahrungsblut einer Mahlzeit bis zu einem Jahr leben, bereits innerhalb der ersten beiden Wochen nach der Nahrungsaufnahme stattfindet. Die Mechanismen, die zur Freisetzungen des Materials aus den einzelligen Drüsen führen, sind bislang weitestgehend ungeklärt. Innerhalb dieser Arbeit konnten erste Beiträge geleistet werden, indem elektronenmikroskopisch nachgewiesen wurde, dass die Speicheldrüsenzellen Vesikel enthalten, in denen wahrscheinlich die sekretorischen Speichelinhaltsstoffe vorliegen. Zudem wurde gezeigt, dass Na+/K+-ATPase-Moleküle in nur sehr geringer Abundanz in den Drüsenzellen vorkommen, V-ATPase-Moleküle, die sekundäre Ionentransporte energetisieren (Erhöhung der intrazellulären Osmolyt-Konzentration) und zur Freisetzung des sekretorischen Materials (Platzen der Vesikel) führen könnten, jedoch sehr prominent sind.As a consequence of host-parasite co-evolution, the blood-sucking leech Hirudo verbana secretes a complex mixture of bioactive salivary proteins and peptides into the wound in host skin at the feeding site. The proteinaceous compounds of saliva, produced in unicellular salivary gland cells and injected through tiny salivary ductule openings in the jaws, assist these blood-sucking ectoparasites in proper feeding and subsequent long-term storage of blood in their crops. Among other effects, bioactive ingredients of leech saliva may suppress pain or inflammatory reactions in the host and prevent blood coagulation. Although leeches have been used for medical purposes in humans for hundreds of years, the only salivary protein that is well characterized in pharmacological terms is hirudin, a highly effective thrombin inhibitor. While the literature reports qualitative information on their potential functions for some other saliva ingredients, data on pharmacokinetics or pharmacodynamics of these substances are lacking. Moreover, it was completely unknown as yet, whether the amounts of individual proteins transferred by the leech to the host during feeding are sufficiently high to exert systemic pharmacological effects. Furthermore, as yet unknown are the mechanisms of saliva release during feeding as well as the time course of synthesis of salivary proteins upon feeding and release of salivary proteins from the gland cell reservoirs. Using a 3D reconstruction of a tissue block from the anterior body part of the leech containing the salivary gland cells, we extrapolated a total number of approximately 37,000 salivary glands cells per leech and calculated an average volume of 67,000 μm3 for an individual salivary gland cell. Moreover we determined the protein content (approx. 500 μg/mm3) in salivary gland cells. Using these data, we calculated a total amount of up to 1.2 mg of stored salivary proteins and peptides in one leech. Histological observations revealed that leeches empty their salivary gland cells during feeding to an extent of 50 - 100 %. Analyzing protein extracts of unfed and fed leeches by 2D electrophoresis, we calculated that approximately 20 different salivary proteins may reach concentrations between 3 and 236 pmol/l in the systemic circulation of a human host (assuming a plasma volume of 5 l). In comparison with hirudin, such concentrations seem sufficiently high to exert pharmacological effects in the host. Since leeches are opportunistic parasites that have access to potential hosts only periodically, they may take up to 10-fold their own body weights during one blood meal. The ingested blood is stored in a large crop for up to one year. We set out to investigate the time course of salivary protein synthesis and refilling of the salivary gland cell reservoirs upon feeding. Using images of Azan-stained longitudinal sections of leeches prepared at different times after feeding, we analyzed the increase in the mean area of salivary gland cell reservoirs over time after feeding as a proxi for their increasing filling state. Additionally, we determined the levels of hirudin complementary DNA (cDNA) prepared from total RNA extracted at 1, 3, 5, 7, 14 and 21 days after feeding. Both subprojects indicate that the bout of salivary protein synthesis takes place within the first week after feeding. To investigate the mechanisms of saliva release from the gland cell reservoirs we prepared histological sections of the anterior leech body part including the salivary gland cells. Using immunohistochemical and immunofluorescence techniques we detected vacuolar-type H+-ATPases (V-ATPase) directly associated with the salivary gland cells. Accompanying electron microscopic studies provided evidence for the presence of cargo vesicles inside the salivary gland cell reservoirs that may be filled with secretory proteins and peptides. Based on these preliminary findings, a model for the mechanism of saliva release during feeding has been developed which may be used to derive working hypotheses for more detailed studies. According to this model, the V-ATPase may energize secondary transporters (for instance a K+/H+-antiporter), whose activities may increase the osmolyte content and the influx rate of water into the vesicles, finally resulting in bursting of the vesicles and outflow of salivary gland cell material into the host skin wound