ATP6AP2 is critically involved in adult hippocampal neurogenesis and reveals stage-specific functions for Wnt/ß-Catenin and Wnt/Planar Cell Polarity (PCP) signaling

The dentate gyrus (DG) of the hippocampus is one of the stem cell housing niches in the adult mammalian brain. Canonical Wingless-type (Wnt) signals provided by the microenvironment are one of the major niche factors that regulate the differentiation of adult neural stem cells (aNSCs) towards the neuronal lineage. Wnts are part of a complex and diverse set of signaling pathways with a wide range of possible interactions. It remains unknown whether different canonical and non-canonical Wnt signals act in a stage-specific manner to regulate distinctive steps of adult hippocampal neurogenesis. Using in vitro assays on adult hippocampal NSCs, we identified an attenuation of canonical Wnt/ß-Catenin signaling responsiveness in the course of neuronal differentiation, while non-canonical Wnt/Planar Cell Polarity (PCP) signaling events progressively increased. Single-cell genetic manipulations were performed by using retroviral vectors to target dividing progenitor cells in the murine hippocampus. Retrovirus-mediated knockdown of ATP6AP2, a recently discovered core protein involved in both Wnt signaling pathways, revealed that the dual role of this adaptor protein is dependent on the signaling context that is present. We were able to confirm its dual role in neurogenic Wnt signaling in cultured adult hippocampal progenitors (AHPs) for both canonical Wnt signaling in proliferating AHPs and non-canonical Wnt signaling in differentiating AHPs. Specific knockdown of ATP6AP2 in neural progenitor cells in vivo resulted in a decreased induction of neuronal cell fate and severe morphological defects of newborn neurons, likely via altering both canonical and non-canonical Wnt signaling. Furthermore, in vivo knockdown of PCP core proteins CELSR1-3 and FZD3 mimicked the maturational defects of ATP6AP2-deficient neuroblasts but did not affect granule cell fate. In summary, the data presented here characterize a transition of Wnt signaling responsiveness from Wnt/ß-Catenin signaling to non-canonical Wnt/PCP signaling in the course of granule cell fate that was confirmed in a human pluripotent stem cell (hPSC)-based model of dentate granule neurogenesis. Our findings suggest that these pathways show stage-dependent activities and regulate distinct steps of adult dentate granule cell neurogenesis. Conclusively, we provide evidence for a stage-specific regulation of fate determination through the Wnt/ß-Catenin pathway and granule cell morphogenesis through the Wnt/PCP signaling pathway, including the FZD3-CELSR1-3 system. Additionally, the Wnt adaptor protein ATP6AP2 is involved in earlier and later stages of adult neurogenesis and its knockdown in vivo resembles all phenotypic features of both canonical and Wnt/PCP signaling mutants.Der Gyrus dentatus des Hippocampus ist eine von zwei beschriebenen neurogenen Regionen im Säugetiergehirn, die zeitlebens eine isolierte Umgebung für teilungsfähige Zellen bereitstellen. Spezielle von der Umgebung freigesetzte Signalmoleküle, insbesondere jene der Wingless-type (Wnt) Signalproteinfamilie, regulieren die Differenzierung adulter neuronaler Stammzellen in Richtung eines neuronalen Zelltyps. Wnt Proteine sind Teil eines komplexen Signalgeschehens mit einer Vielzahl von unterschiedlichen Signalwegen, welche die Basis für ein breites Spektrum möglicher Interaktionen bieten. Ob und inwiefern verschiedenartige Wnt Signalwege zellstadienspezifisch agieren, um unterschiedliche Entwicklungsschritte adulter Neurogenese zu regulieren, ist bislang unbekannt. Durch in vitro Experimente mit kultivierten adulten hippocampalen neuronalen Stammzellen konnten wir zeigen, dass sich im Zuge neuronaler Differenzierung die Rezeptivität auf den anfänglich dominanten Wnt/ß-Catenin Signalweg stark vermindert, während Signalereignisse des Wnt/PCP Signalweges progressiv zunehmen. Selektive Genmanipulationen in proliferierenden Stammzellen des Hippocampus konnten durch den Einsatz retroviraler Techniken in vivo vorgenommen werden. Eine durch RNA-Interferenztechniken induzierte Reduktion der Expression des kürzlich entdeckten Adapterproteins ATP6AP2, welches in beide Wnt Signalgeschehen involviert ist, konnte zeigen, dass dessen duale Funktion stark von den kontextuellen zellulären Wnt Signalereignissen abhängt. Seine duale Funktion im neurogenen Wnt Signalgeschehen konnten wir zudem in adulten hippocampalen Progenitorzellen in vitro bestätigen. Der spezifische Gen-Knockdown in vivo minimierte die Fähigkeit der Stammzellen, einen neuronalen Nachfolger zu produzieren, während ATP6AP2-defiziente Neuroblasten, jene Stammzellnachfolger, die einen neuronalen Phänotypen angenommen haben, schwerwiegende morphologische Defekte aufwiesen. Diese Defekte sind vermutlich auf die Manipulation beider Signalwege zurückzuführen. Weiterhin konnten Manipulationen am Wnt/PCP Signalweg mit Hilfe von Gen-Knockdown Experimenten an den essentiellen PCP Komponenten FZD3 und CELSR1-3 zeigen, dass jene in ATP6AP2-defizienten Neuroblasten charakterisierten Reifungsdefekte auch in PCP Mutanten vorhanden sind. Die Determinierungsfähigkeit der Stammzellen, eine hippocampale Körnerzelle zu produzieren, war in allen untersuchten PCP Mutanten nicht beeinträchtigt. Anhand der hier gewonnen Daten ließ sich ein Übergang vom Wnt/ß-Catenin zum Wnt/PCP Signalgeschehen im Zuge adulter hippocampaler Neurogenese charakterisieren, dessen Existenz ebenfalls in einem auf pluripotenten Stammzellen basierenden humanen Modellsystem bestätigt werden konnte. Die Ergebnisse der vorliegenden Promotion lassen vermuten, dass die beiden untersuchten Wnt Signalwege stadienspezifische Aktivitäten aufweisen und dadurch nur bestimmte Entwicklungsschritte adulter hippokampaler Neurogenese regulieren. Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass der Wnt/ß-Catenin Signalweg im Kontext adulter hippocampaler Neurogenese die Determinierung der Stammzelle zur Körnerzelle kontrolliert, während der Wnt/PCP Signalweg durch das FZD3-CELSR1-3 System in späteren Stadien zur regulierten morphologischen Spezifizierung differenzierender Körnerzellen beiträgt. Das Wnt Adapterprotein ATP6AP2 erschien in frühe und späte Phasen adulter Neurogenese involviert zu sein. ATP6AP2-defiziente Zellen zeigten zusammengenommene Defekte beider Wnt Signalweg Mutanten