Charakterisierung der anti-PF4/Heparin-Antikörper-sezernierenden B-Zellen im Mausmodell nach systemischer Immunisierung

Zusammenfassung: Heparin ist ein häufig verwendetes Medikament, das zur Prophylaxe und Therapie von Thrombosen eingesetzt wird. Eine unerwünschte Nebenwirkung des Heparins ist die Heparin-induzierte Thrombozytopenie (HIT), die paradoxerweise mit potentiell lebensbedrohlichen arteriellen und venösen Gefäßverschlüssen assoziiert ist. Die Erkrankung wird durch die Bil-dung von Thrombozyten-aktivierenden Antikörpern der Klasse Immunglobulin G (IgG) aus-gelöst. Diese sind gegen Komplexe aus dem Thrombozytenprotein Plättchenfaktor 4 (PF4) und Heparin gerichtet. Die zugrunde liegende B-Zell-vermittelte Immunität entspricht nicht der klassischen Immunantwort und führt zu einer frühzeitigen und transienten Produktion von anti-PF4/Heparin-Antikörpern der Klassen IgM und IgG. In der vorliegenden Arbeit wurden die B-Zellen, die an der Produktion von anti-PF4/Heparin-Antikörpern beteiligt sind, identifiziert. Hierfür wurden die Mäuse systemisch mit PF4/Heparin-Komplexen immunisiert. Das Vorliegen einer Immunantwort wurde durch den Nachweis der Antikörperproduktion mittels eines neu entwickelten Fluid-Phase ELISA nach-gewiesen. Der Einsatz von rekombinanten Maus-PF4/Heparin-Komplexen zeigte, dass die beim Menschen für die HIT charakteristisch frühe und transiente Antikörperproduktion auch im Mausmodell auftritt. Diese Immunantwort war spezifisch für PF4/Heparin-Komplexe und konnte nicht durch andere unspezifische Reize wie ein Gewebetrauma oder dem Modellanti-gen Ovalbumin ausgelöst werden. Der Nachweis der anti-PF4/Heparin-Antikörper-sezernierenden B-Zellpopulation(en) wurde durch die Etablierung des Zell-spezifischen Enzym-gekoppelten Immun-Spot Tests (ELISPOT) auf der Fluid-Phase Basis – Detektion der PF4/Heparin-Antikörper-Komplexe in der löslichen Phase – ermöglicht. Unterschiedliche Gewebe/Kompartimente (Milz, Knochen-mark, Peritonealhöhle) von naiven, nicht-immunisierten und PF4/Heparin-immunisierten Mäusen wurden mit diesem Assay auf das Vorliegen von PF4/Heparin-spezifischen B-Zellen untersucht. Während in nicht-immunisierten Mäusen ausschließlich B-Zellen nachgewiesen werden konnten, die anti-PF4/Heparin-Antikörper der Klasse IgM produzierten, wurden in immunisierten Mäusen sowohl kurzlebige PF4/Heparin-spezifische IgM (7%)- als auch IgG (25%)-sezernierende B-Zellen detektiert. Die spezifischen Zellen befanden sich in beiden Fällen in der Milz. Dieses Gewebe dient als Nische für follikuläre, Marginalzonen (Mz)- und B1-B-Zellen, wobei sie im Fall der Mz-B-Zellen die einzige Überlebensnische darstellt. Den Hauptanteil der Antikörper-produzierenden Milzzellen bilden die follikulären B-Zellen, deren Antikörperproduktion T-Zell-abhängig ist. Als Hauptquelle der anti-PF4/Heparin-Antikörper konnte diese Zellpopulation ausgeschlossen werden, da T-Zell-defiziente Mäuse nach der Behandlung mit PF4/Heparin weiterhin spezifische Antikörper produzierten. Normale Mäuse, denen vor der PF4/Heparin-Behandlung die Milz und somit die Mz-B-Zellen operativ entfernt wurden, konnten hingegen keine anti-PF4/Heparin-Antikörper mehr bilden. Dies zeigt, dass B1-Zellen allein nicht ausreichend sind, um die anti-PF4/Heparin-Antikörperproduktion zu induzieren, und dass Mz-B-Zellen für die Immunantwort notwendig sind. Der Mechanismus, der die Aktivierung der PF4/Heparin-spezifischen Mz-B-Zellen auslöst, ist bisher nicht im Detail bekannt. Jedoch konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die in vitro Stimulation von B-Zellen mit Mitogenen wie CpG und SAC antigenunabhängig zur Produktion von anti-PF4/Heparin-Antikörpern führt. Dies lässt vermuten, dass neben dem Kontakt mit dem Antigen auch andere immunstimulatorische Faktoren in die Induktion der Immunantwort gegen Maus-PF4/Heparin-Komplexe involviert sind.Summary: Heparin is frequently used for the prophylaxis and treatment of thrombosis. A side effect of heparin is the heparin-induced thrombocytopenia (HIT), which is paradoxically associated with potentially life-threatening arterial und venous occlusions. The disease is caused by the formation of platelet-activating antibodies of the immunoglobulin G (IgG) class. These anti-bodies are directed against complexes of the platelet protein platelet factor 4 (PF4) and hepa-rin. The underlying B-cell-mediated immunity is not a classical immune response and leads to an early and transient production of anti-PF4/heparin antibodies of the IgM and IgG class. In the present thesis, the B cells that are involved in the production of anti-PF4/heparin anti-bodies were characterized in a mouse model. For this purpose, mice were systemically immunized with PF4/heparin complexes. The immune response was monitored by the detec-tion of antibody production by a newly developed Fluid-phase ELISA. Complexes of recom-binant mouse PF4 and heparin induced an early and transient antibody production, character-istic for HIT in humans, occurs also in the mouse model. This immune response was specific for PF4/heparin complexes and could not be triggered by other non-specific stimuli such as tissue trauma or the model antigen ovalbumin. The detection of the B-cell population(s) secreting anti-PF4/heparin antibodies was enabled by the establishment of the cell-specific enzyme-linked immunosorbent spot tests (ELISPOT), which used the fluid phase principle – detection of PF4/heparin-antibody complexes in the fluid phase –. Different tissues/compartments (spleen, bone marrow, peritoneal cavity) of naive, non-immunized mice and PF4/heparin-immunized mice were examined with this assay for the presence of PF4/heparin-specific B cells. While in non-immunized mice only B cells were detected, which produced anti-PF4/heparin antibodies of the IgM class, in immunized mice both short-lived PF4/heparin-specific IgM (7%)- and IgG (25%)-secreting B cells were determined. In both cases the specific cells were located in the spleen. This tissue harbors follicular, marginal zone (Mz) and B1 B cells, whereby the spleen is the only survival niche for Mz B cells. The greatest fraction of antibody-secreting splenocytes are follicular B cells, which produce antibodies in a T cell dependent manner. As main source of the anti-PF4/heparin antibodies this cell population could be excluded since T cell-deficient mice treated with PF4/heparin produced anti-PF4/heparin antibodies. In contrast, normal mice lacking the spleen and thereby Mz B cells were no longer able to produce anti-PF4/heparin antibodies. This indicates that B1 cells alone are not sufficient to induce the specific immunity and that Mz B cells are necessary for the PF4/heparin-induced immune response. The mechanism that triggers the activation of the PF4/heparin-specific Mz B cells is not known in detail, yet. However, in this thesis it was shown that an in vitro stimulation of B cells with mitogens such as CpG and SAC led antigen-independently to the production of anti-PF4/heparin antibodies. This suggests that in addition to the antigen contact also other immune-stimulatory factors are involved in the induction of the immune response against mouse PF4/heparin complexes