Virulenzfaktoren von Staphylococcus aureus und ihre Wirkungen auf humane Atemwegsepithelzellen - Signaltransduktion und zelluläre Effekte

Die Atemwege sind mögliche Eintrittspforten für Staphylococcus aureus in den menschlichen Organismus. Inhalierte Bakterien oder Bakteriencluster kommen initial vermutlich nicht direkt mit den Epithelzellen der Atemwege in Kontakt, sondern nur mit der aufgelagerten Mukusschicht. Die Mikroorganismen nehmen in dieser Situation möglicherweise über sekretorische lösliche Virulenzfaktoren auf die Funktion der Epithelzellen Einfluss und können dadurch das Infektionsgeschehen für sich günstig beeinflussen. Die Behandlung einer Infektion ist oft schwierig, da viele S. aureus-Stämme resistent gegenüber Antibiotika sind. Es ist daher von großem Interesse, mehr über die vielfältigen Interaktionen dieser Bakterien mit ihren eukaryotischen Wirtszellen in Erfahrung zu bringen. Bisher ist nur wenig über die Reaktionen humaner Atemwegsepithelzellen auf Kontakt mit S. aureus-Sekretionsprodukten bekannt, deswegen wurden in dieser Arbeit die Effekte der löslichen Virulenzfaktoren, Hämolysin A und B, auf die Zellmorphologie, Zytokinsezernierung und Ca2+-Signaltransduktion in verschiedenen humanen Atemwegsepithelzellen (16HBE14o-, S9, A549) genauer charakterisiert. Unter rHla-Einwirkung konnte in konfluenten Zellrasen die Bildung parazellulärer Lücken beobachtet werden, wobei die Stärke der Reaktion zelltypspezifisch war. Für die in vivo-Situation könnte der Verlust des stabilen Zellverbands bedeuten, dass das Bakterium dadurch die Möglichkeit erhielte, in den Wirtsorganismus einzudringen. Die Untersuchungen an primären Nasenepithelzellen unterstützen diese Schlussfolgerung. Hingegen zeigten Hämolysin B und die bakteriellen Zellwandbestandteile Lipoteichonsäure und Peptidoglykan kaum Effekte auf die Morphologie der Zellen. Durch fluorometrische Messung mit Indo1-beladenen Zellen wurde deutlich, dass die rHla-Behandlung und der daraus resultierende Einbau von Hla-Poren in die Membran der Atemwegsepithelzellen zu einem Ca2+-Einstrom in die Zellen führen. Wurden die A549-Zellen mit höheren Hla-Konzentrationen behandelt, war der Ca2+-Einstrom sehr stark und konnte nicht durch den zelleigenen Ca2+-Auswärtstransport kompensiert werden, so dass die intrazelluläre Ca2+-Konzentration [Ca2+]i stetig anstieg. Diese Ca2+-Überladung könnte zur Schädigung der Zellen oder gar zum Absterben einiger Zellen beigetragen haben, was in den Experimenten mit dem Time lapse-Mikroskop beobachtet wurde. Auch die Behandlung der A549-Zellen mit rHlb, durch dessen Sphingomyelinase-Aktivität Spaltprodukte entstehen können, die selbst als Signalmoleküle fungieren, führte zu einer leicht veränderten [Ca2+]i in den A549-Zellen. Ob dieses durch Sphingosin-1-Phosphat erfolgt, das in A549-Zellen tatsächlich ein deutliches Ca2+-Signal erzeugt, oder durch andere Hlb-bedingte Effekte auf die Zellen, wurde nicht abschließend geklärt. Auch der direkte Einfluss der beiden Hämolysine auf die Freisetzung von pro-inflammatorischen Zyto- und Chemokinen aus den Atemwegsepithelzellen unter rHla und rHlb wurde quantitativ bestimmt. Mit Hilfe von FlowCytomix-Kits konnte ebenfalls gezeigt werden, dass beide Hämolysine die Sekretion von IL-6 und IL-8 aus den Zellen bewirken. Um die physiologischen Vorgänge im respiratorischen Gewebe nach Kontakt mit S. aureus bzw. dessen Virulenzfaktoren zu ergründen, wurden in dieser Arbeit verschiedene endogene Proteinkinasen und Signalmoleküle der Atemwegsepithelzellen pharmakologisch inhibiert und untersucht, wie sich die selektive Hemmung der Signaltransduktion auf die Lückenbildung im Zellrasen unter der Stimulation mit rHla auswirkt. Da die intrazelluläre Konzentration von Ca2+-Ionen für die Steuerung der Salz- und Wassersekretion im respiratorischen Gewebe und somit für die Abwehr potentieller Pathogene wichtig ist, wurden für diese Arbeit einige Schlüsselelemente dieses Systems analysiert. Die Resultate weisen auf eine komplexe Verbindung der Signalwege hin, wobei die Zellantworten häufig Zelltyp-spezifisch waren. Es konnte durch Time lapse-Beobachtungen gezeigt werden, dass Calmodulin, c-Src, Calpaine, die Proteinkinasen A, G, B und C sowie NF-κB den Zellen tendenziell helfen, ihre Zellform unter rHla-Einwirkung zu bewahren. Für Calmodulin, die Ca2+/CaM abhängige Kinase II, ERK1/2, p38 und NF-κB wurde eine Beteiligung an der Erhöhung der Sekretionsraten von IL-8 und IL-6 durch rHla sowie rHlb festgestellt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die untersuchten Signalwege, je nach Intensität der Einwirkung der bakteriellen Faktoren auf die Atemwegsepithelzellen, sowohl zellprotektive als auch Epithel-beeinträchtigende Prozesse beeinflussen, jedenfalls aber in die Produktion von Signalen (Freisetzung von Zyto- und Chemokinen) eingebunden sind, die solcherart Epithelzellen in vivo an das Immunsystem eines Wirts senden.The airways are potential entry doors for Staphylococcus aureus into the human host organism. Supposedly, inhaled bacteria or bacterial clusters do not come initially in direct contact with the epithelial cells of the respiratory tract, but only with the superimposed mucus layer. In this situation, the microorganisms may use secretory soluble virulence factors to effect the function of the epithelial cells and therefore the infection situation gets favorable to themselves. The therapy of an infection is often difficult, as many S. aureus strains are resistant to antibiotics. It is of great interest to learn more about the various interactions of these bacteria with their eukaryotic host cells. So far, little is known about the reactions of human airway epithelial cells after the contact with S. aureus secretory products, so in this thesis the effects of soluble virulence factors, hemolysin A and B, were investigated on cell morphology, the secretion of cytokines and Ca2+ signal transduction in several human airway epithelial cells (16HBE14o-, S9, A549). After the treatment with recombinant hemolysin A (rHla), the formation of paracellular gaps could be observed in confluent cell layers, the magnitude of the response was cell type specific. For the in vivo situation, the loss of the stable united cell structure could mean that the bacteria thus would receive a chance to enter into the host organism. The studies of primary nasal epithelial cells support this conclusion. On the other hand recombinant hemolysin B (rHlb) and the bacterial cell wall components lipoteichoic acid and peptidoglycan showed hardly any effect on the morphology of the cells. By fluorometric measurement with Indo1-loaded cells it became obvious that the rHla treatment and the resulting installation of Hla-pores in the membrane of airway epithelial cells lead to a Ca2+ influx into the cells. In A549 cells that were treated with higher Hla concentrations, the Ca2+ influx was very strong and could not be compensated by the cells own Ca2+ outwards transport systems, so that the intracellular Ca2+ concentration [Ca2+]i rose steadily. This Ca2+ overcharge could have caused injury to the cells or even the death of some cells, as observed in the experiments with the time lapse microscope. The treatment of A549 cells with rHlb, that because of its sphingomyelinase activity produces fission products which act as signaling molecules, resulting in a slightly altered [Ca2+]i in A549 cells. Whether this is done by sphingosine-1-phosphate, which actually creates a clear Ca2+ signal in A549 cells, or by other Hlb-related effects on the cells was not clarified. The direct influence of the two hemolysins on the release of pro-inflammatory cytokine and chemokines from the airway under rHla and rHlb was determined quantitatively. Using FlowCytomix kits it could also be shown that both hemolysins cause the secretion of IL-6 and IL-8 from the cells. To explore the physiological processes in the respiratory tissues after contact to S. aureus or its virulence factors, various endogenous protein kinases and signaling molecules of airway epithelial cells were inhibited pharmacologically and it was examined how the selective inhibition of signal transduction effect the gap formation in the cell layer under the stimulation with rHla. Because the intracellular concentration of Ca2+ ions is important for the control of salt and water secretion in the respiratory tissues and thus for the defense of potential pathogens, some key elements of this system were analyzed for this thesis. The results indicate a complex relation of signaling pathways, the cell responses were often cell type-specific. It was shown by time lapse observations that Calmodulin, c-Src, Calpains, the protein kinases A, G, B, and C as well as NF-KB help the cells to keep their cell shape after rHla contact. It was discovered that Calmodulin, Ca2+/CaM depending kinase II, ERK1/2, p38 and NF-κB participate in the secretion of IL-6 and IL-8 under rHla and rHlb. The results suggest that the studied signaling pathways, depending on the concentration of the bacterial factors, affecting both cell-protective and epithelial affecting processes, but at least they are involved in the production of signals (release of cyto- and chemokines) that send epithelial cells in vivo to the immune system of a host