Zur Eignung von Gd-EOB-DTPA zur Visualisierung des Transportes von Arzneimitteln zum Ort der Wirkung

Gadolinium-Ethoxybenzyl-Diethylentriaminpentaessigsäure (Gd-EOB-DTPA) ist ein leberspezifisches Magnetresonanztomographie (MRT)-Kontrastmittel. Es ist ein häufig in der Klinik eingesetztes Diagnostikum bei fokalen Leberläsionen. Im Vergleich zu anderen Gadolinium-haltigen Kontrastmitteln wird Gd-EOB-DTPA spezifisch von gesunden Hepatozyten aufgenommen. Somit ist es bei der Erkennung von hepatischen Tumoren von großer Bedeutung. Nach einer Bolusinjektion wird Gd-EOB-DTPA bis zu 50% über die Galle und 50% über die Nieren ausgeschieden. Die Mechanismen der hepatischen Aufnahme und der biliären Elimination sind bisher nur unzureichend verstanden. Ein weiterführendes Verständnis ist aber auch nötig, um die großen interindividuellen Unterschiede der Leberanreicherung von Gd-EOB-DTPA bei Patienten zu erklären und auch mögliche Arzneimittelinteraktionen vorhersagen zu können. Deswegen war das Ziel der vorliegenden Dissertation, erstens die Transportmechanismen des Kontrastmittels in in vitro Experimenten und dabei sowohl die Aufnahme- also auch die Effluxtransporterproteinen zu untersuchen. Zweitens wurde ein Tierexperiment in Wildtyp- und Abcc2-definzienten Ratten durchgeführt, um die Mechanismen der hepatobiliären Elimination von Gd-EOB-DTPA zu untersuchen und den intestinalen Arzneimitteltransportweg mit Hilfe des bildgegebenden Verfahrens MRT zu visualisieren. Diese in vitro-Untersuchungen zeigten, dass Gd-EOB-DTPA ein Substrat der leberspezifischen Transporter OATP1B1, OATP1B3 und NTCP, aber nicht des ubiquitären OATP2B1 ist. Hiermit kann die hohe Leberspezifität des Kontrastmittels erklärt werden. In vitro wurde Gd-EOB-DTPA von allen genetischen Varianten des OATP1B1 mit unterschiedlichen Km-Werten aufgenommen, wobei die *1b Variante eine signifikant erhöhte Transportkapazität im Vergleich zum Wildtyp (WT) zeigte. Allerdings sieht man bei OATP1B1*5 (nicht signifikant) und *15 (signifikant) eine verringerte Aufnahme von Gd-EOB-DTPA. Bei OATP1B3, zeigte die Variante p.233Ile eine signifikant niedrigere Substrat-Affinität in vitro. Gd-EOB-DTPA wurde über den Polymorphismus p.112Ala/233Ile mit einer signifikant niedrigeren Transportaktivität aufgenommen im Vergleich zum WT. Nach intravenöser Applikation von Gd-EOB-DTPA in Wildtyp- und Abcc2-defizienten Ratten wurde gezeigt, dass Abcc2 eine zentrale Rolle für die hepatobiliäre Ausscheidung von Gd-EOB-DTPA spielt. Gleichzeitig wurde gezeigt, dass bei Abcc2-defizienten Ratten die Ausscheidung des Kontrastmittels vollständig über die Nieren kompensiert wird. In Abcc2-defizienten Ratten ist die Expression des in der basolateralen Membran der Hepatozyten exprimierten Effluxtransporters Abcc3 signifikant erhöht. In vitro konnte eine konzentrationsabhängige Aufnahme von Gd-EOB-DTPA in ABCC2- bzw. ABCC3-enthaltende inside-out Vesikel dargestellt werden. Abcc3 könnte ein Kandidat für den Rücktransport von Gd-EOB-DTPA aus den Hepatozyten ins Blut sein. ABCC2 und ABCC3 sind auch im Darm exprimiert. Da Gd-EOB-DTPA ein Substrat von ABCC2 und ABCC3 ist, wurde untersucht, ob das Kontrastmittel auch im Darm absorbiert wird und somit die Absorption von Arzneimitteln visualisiert werden könnte. Nach oraler Gabe wurde Gd-EOB-DTPA im Darm der Ratten hinreichend absorbiert (Bioverfügbarkeit 17%). Für den intestinalen Efflux scheint ABCC2 von großer Bedeutung zu sein. Denn nach oraler Applikation stieg die Bioverfügbarkeit von Gd-EOB-DTPA in Abcc2-defizienten Ratten von 17% auf 25%. Zusammenfassend konnte die vorliegende Dissertation verdeutlichen, dass Gd-EOB-DTPA ein in vitro-Substrat der leberspezifischen Transporter OATP1B1, OATP1B3 und NTCP ist und auch von OATP1A2, ABCC2 und ABCC3 prozessiert wird. Der Arzneistoff ist somit ein gutes Beispiel für das komplexe Wechselspiel von intestinalem und hepatischem Aufnahme- und Effluxtransport, welcher für zahlreiche Stoffe bereits gut etabliert ist (z.B. Statine, Ezetmib). Es konnte gezeigt werden, dass die leberspezifische Aufnahme von Gd-EOB-DTPA über OATP1B1 und OATP1B3 realisiert wird, wohingegen ABCC2 den wesentlichen Effluxtransporter der hepoatobiliären Elimination darstellt. Die Arbeit konnte des Weiteren zeigen, dass genetische Varianten eine plausible Erklärung für die in der klinischen Praxis beobachtete hohe interindividuelle Variabilität der Leberanreicherung wären. Basierend auf den in vitro- und in vivo-Ergebnissen erweist sich, Gd-EOB-DTPA als neues „probe drug“, um den Absorptionsweg von Arzneimitteln zu visualisieren und die Funktion der Transporter zu charakterisieren.Gadolinium ethoxybenzyl diethylenetriaminepentaacetic acid (Gd-EOB-DTPA) is a liver-specific magnetic resonance imaging (MRI) contrast agents. It is a widely used in clinical diagnostic use in focal liver lesions. Compared to other gadolinium-containing contrast agents Gd-EOB-DTPA is specifically taken up by hepatocytes. After intravenously bolus injection of Gd-EOB-DTPA is excreted up to 50% via the biliary and 50% via the kidneys. The mechanisms of hepatic uptake and biliary elimination are poorly understood. A further understanding is also needed to explain the large interindividual differences in liver accumulation of Gd-EOB-DTPA in patients and also to predict possible drug interactions. Therefore, the aim of this thesis was to explain the transport mechanisms of the contrast agent. Firstly in vitro experiments, the substrate affinity of Gd-EOB-DTPA would be examined in stable transfected cells. Secondly, an animal experiment was performed in wild-type and Abcc2 deficient-rats to investigate the mechanisms of hepatobiliary elimination of Gd-EOB-DTPA and to visualize the intestinal drug absorption using MRI procedure. These in vitro studies showed that Gd-EOB-DTPA is a substrate of the liver-specific transporters OATP1B1, OATP1B3 and NTCP, but not the ubiquitous OATP2B1. Therefore high liver specificity of the contrast agent can be explained. In vitro Gd-EOB-DTPA was taken up by all genetic variants of OATP1B1 with different Km values, the * 1b variant showed a significantly increased transport capacity compared to the wild type (WT). However the OATP1B1 * 5 (not significant) and 15 * (significant) showed a decreased uptake of Gd-EOB-DTPA. For OATP1B3, showed the variant p.233Ile a significantly lower substrate affinity in vitro. Gd-EOB-DTPA was taken up to the polymorphism p.112Ala/233Ile with a significantly lower transport activity compared to the WT. After intravenous administration of Gd-EOB-DTPA in wild-type and Abcc2-deficient rats has been shown that Abcc2 plays a important role in the hepatobiliary excretion of Gd-EOB-DTPA. At the same time it was shown that in Abcc2-deficient rat the elimination of the contrast agent is fully compensated by the kidneys. In Abcc2-deficient rats expression of ABCC3, which expresses in the basolateral membrane of the hepatocytes, is significantly increased. In vitro, a concentration-dependent uptake of Gd-EOB-DTPA was shown in ABCC2 or ABCC3-containing inside-out vesicles. ABCC3 could be a candidate for the return transport of Gd-EOB-DTPA from the hepatocytes into the blood. ABCC2 and ABCC3 are also expressed in the intestine. Since Gd-EOB-DTPA is a substrate of ABCC2 and ABCC3, it was investigated whether the contrast agent is also absorbed in the intestine and thus the absorption of drugs could be visualized. After oral administration of Gd-EOB-DTPA was absorbed (bioavailability 17%) in the intestine of rats. ABCC2 seems to be of great importance, because the bioavailability after oral administration of Gd-EOB-DTPA in Abcc2-deficient rats increased from 17% to 25%. In summary, this dissertation illustrate that Gd-EOB-DTPA is an in vitro substrate of the liver-specific transporters OATP1B1, OATP1B3 and NTCP. It is also a substrate OATP1A2, ABCC2 and ABCC3. The drug is therefore a good example of the complex interplay between intestinal absorption and hepatic and Effluxtransport, which for many substances already well established (eg, statins, Ezetmib). It was shown that the liver-specific uptake of Gd-EOB-DTPA is realized by OATP1B1 and OATP1B3, whereas ABCC2 represents the major efflux transporter of hepoatobiliären elimination. The work could further show that genetic variants would be a plausible explanation for the in clinical observed high interindividual variability of liver enrichment. Based on the in vitro and in vivo results of Gd-EOB-DTPA turns out, that Gd-EOB-DTPA is a new "probe drug" to visualize the absorption of drugs and to characterize the function of the transporter