Roles of neutrophil NADPH oxidase derived reactive oxygen species (ROS) in innate responses

I have investigated the role played by reactive oxygen species (ROS) generated by the phagocyte NADPH oxidase system in the innate immune response. I first looked at effector functions by asking whether ROS released from phagocytes might be effective in the killing of extracellular bacteria. Since bacteria can be killed in many other ways – for example by proteases or by cationic peptides – I made use of the recently demonstrated capacity of ROS to remove discontinuities from the surface of gold as the basis of an in vivo assay for extracellular ROS. Unlike bacterial killing, this readout system is not affected by enzymes, cationic peptides or other biological anti-bacterial agents. By this means I was able to use wild type mice and a congenic strain which lacks the gene coding for the gp91 subunit of the phagocyte NADPH oxidase to demonstrate that ROS generated by the NADPH oxidase system are indeed found outside the cells during an inflammation in vivo and that their principle source is neutrophil granulocytes rather than tissue macrophages. Since ROS released by these cells will be non-specific in its action it is to be expected that the releasing cell will itself suffer considerable damage. This fits well to the known short life of activated neutrophils and may explain the established fact that their death is dependent on the NADPH oxidase system. The long lived macrophages, in contrast, restrict their production of extracellular ROS. ROS are increasingly being found to be involved in both intra and intercellular signalling processes I looked for an involvement of NADPH oxidase derived ROS in the recruitment of neutrophils to sites of inflammation in vivo. Since the gene coding for the gp91 subunit of the NADPH oxidase is on the X chromosome I made use of a mosaic expression strategy based on X chromosomal inactivation. The results show that indeed ROS serves as a component of the neutrophil recruitment process in the critical early stages of an infection. Possible mechanisms are explored.In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion der reaktiven Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) in der angeborenen Immunantwort untersucht, wobei diese ROS durch das phagozytäre NADPH-Oxidasesystem gebildet werden. Zuerst wurden mögliche Effektorfunktionen der ROS untersucht. Dabei stellte sich die Frage, ob von Phagozyten freigesetzte ROS extrazelluläre Bakterien effektiv abtöten können. Da das Immunsystem über unterschiedliche Mechanismen wie Proteasen oder kationische Peptide verfügt, um Bakterien zu eliminieren, wurde eine kürzlich beschriebene Fähigkeit der ROS genutzt: In einem in vivo-Assay sind extrazelluläre ROS in der Lage, Unebenheiten von Goldoberflächen zu entfernen. Anders als das Abtöten von Bakterien wird dieses read-out-System nicht durch Enzyme, kationische Peptide oder andere biologische, antibakterielle Reagenzien beeinflusst. Es sollte gezeigt werden, dass ROS, die in vivo während einer Entzündung durch das NADPH-Oxidasesystem gebildet werden, 1. sich tatsächlich außerhalb der Zellen befinden und 2. ihr Hauptproduzent neutrophile Granulozyten und nicht Gewebsmakro-phagen sind. Um diesen Nachweis zu führen, wurden kongene Mäuse, defizient für die gp91-Untereinheit der phagozytären NADPH-Oxidase, und Wildtyptiere genutzt. ROS, die von diesen Phagozyten freigesetzt werden, wirken unspezifisch. Daher kann angenommen werden, dass auch die sezernierende Zelle selbst durch diese reaktiven Moleküle beschädigt wird. Die kurze Lebenszeit aktivierter Neutrophilen und die Abhängigkeit ihres Zelltods vom NADPH-Oxidasesystem unterstützen diese Vermutung. Die langlebigen Makrophagen hingegen beschränken sich in der Produktion extrazellulärer ROS. Zusätzlich sind ROS Bestandteile in zahlreichen intra- und interzellulären Signalwegen. Daher sollte nun untersucht werden, ob die durch die NADPH-Oxidase-gebildeten ROS in vivo in die Rekrutierung von Neutrophilen an den Infektionsherd involviert sind. Die gp91-Untereinheit der NADPH-Oxidase ist X-chromosomal kodiert, deshalb konnte eine Mosaik-Expressionsstrategie gewählt werden, die auf der X-chromosomalen Inaktivierung beruht. Damit konnte gezeigt werden, dass ROS tatsächlich zur neutrophilen Rekrutierung in der kritischen, frühen Entzündungsphase benötigt werden. Die zugrunde liegenden Mechanismen werden momentan noch erforscht