Funktionelle Analyse der primären Stressantwort humaner Endothelzellen (Huvec) auf Proteasominhibitoren im kardiovaskulären System

Zusammenfassung Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) ist das wichtigste nicht-lysosomale proteolytische System für den Abbau intrazellulärer Proteine. Die Inhibition des UPS kann dosisabhängig den apoptotischen Zelltod oder die Induktion einer protektiven Stressantwort auslösen. In der therapeutischen Anwendung der Proteasominhibition sind neben der Wirksamkeit auch exakte Kenntnisse der Wirkungsweise essentiell, um die primären Effekte durch die Proteasominhibition besser zu erfassen und die initialen Effekte der Vermittlung dieser zellulären Reaktion besser zu verstehen. In dieser Arbeit wurden Methoden der Proteom- und Transkriptomebene kombiniert, um komplexe zelluläre Veränderungen von Endothelzellen nach Proteasomhemmung zu charakterisieren. Weiterhin wurde mittels Immunpräzipitation Ubiquitin-bindender Proteine untersucht, welche Substrate des Proteasoms nach Proteasomhemmung in Endothelzellen stabilisiert werden. Primäre humane Endothelzellen (Huvec) wurden als Modell gewählt und mit niedrigen bzw. hohen Dosierungen des Proteasominhibitors MG132 behandelt. Das Expressionsprofil wurde in einer Zeitkinetik innerhalb der ersten 6h mittels Affymetrix Chipanalysen bestimmt. Die differentielle Proteinexpression nach zwei Stunden Proteasomhemmung wurde im Gesamtzelllysat durch 2D Gelelektrophorese und anschließende Silberfärbung visualisiert. Dabei konnten mehr als 20 regulierte Proteine identifiziert werden, welche zuvor nicht direkt im Zusammenhang mit der Vermittlung einer protektiven Stressantwort nach niedrig dosierter Proteasomhemmung bekannt waren. Durch Korrelation mit den parallel durchgeführten Expressionsarrays konnte die Regulation dieser Proteine als unabhängig von der Transkription erfasst werden. Die funktionelle Annotation der Daten zeigte dabei eine Anreicherung von Proteinen der zellulären Stressantwort, der intrazellulären Signaltransduktion und des oxidativen Stresses. Diese waren differentiell reguliert nach niedrig bzw. hoch dosierter Proteasominhibition. Während die niedrig dosierte Proteasominhibition ein protektives Genmuster zeigte, induzierten hohe Dosen den apoptotischen Zelltod. Auch konnte, in Abhängigkeit vom Grad der Proteasominhibition, ein deutlicher Anstieg der freien Radikale innerhalb der Zellen nachgewiesen werden, was auf die Vermittlung der Apoptose durch freie Radikale hinweist. Mit DJ-1, Peroxiredoxin-1 und -6 wurden mehrere Sensorproteine für oxidativen Stress identifiziert. Um, neben der Proteom- und Transkriptomanalyse, auch gezielt Substrate der Proteasominhibition zu identifizieren und als mögliche Mediatoren der protektiven Stressantwort zu identifizieren, wurden Gesamtzelllysate mittels Ubiquitin-Immunpräzipitation getrennt und Ubiquitin-bindende Proteine per Massenspektrometrie identifiziert. Dabei konnte ein Set von 22 Proteinen identifiziert werden, welche spezifisch nach 2h an der Ubiquitin-spezifischen Matrix gebunden wurden. In diesem Set finden sich vor allem RNA bindende Proteine, Bestandteile des UPS und ribosomale Proteine. Um gezielt transkriptionelle Mediatoren der protektiven Stressantwort nach partieller Proteasominhibition zu identifizieren, wurde eine Subproteom-Analyse mit nukleären Extrakten von Huvec durchgeführt. Nach Visualisierung mittels DIGE-Labeling und quantitativer Auswertung konnten 361 regulierte Spots nach 2 stündiger Proteasominhibition erfasst werden. Von diesen Spots konnten 319 per MALDI-MS identifiziert werden und 152 verschiedenen Proteinen zugeordnet werden. Die funktionelle Auswertung ergab eine deutliche Überrepräsentation von RNA-bindenden und Splicing-relevanten Proteinen. Auch konnte für HnRNP A1, einem RNA-bindenden Protein, eine funktionelle Methylierung sowie eine Veränderung der subzellulären Lokalisierung nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse deuten auf die Regulation des zellulären Splicings hin. In parallel dazu angefertigten Exon-sensitiven Affymetrix Arrays wurden über 600 Gene mit differentiell regulierten Exons identifiziert, welche vor allem Gene mit Rezeptor- und Transportproteinen kodieren. Auch eine erhöhte Anzahl von Genen mit Methyltransferase-/Kinaseaktivität wurde identifiziert. Insbesondere die Methyltransferasen, welche auch bei der posttranslationalen Modifikation von HnRNP A1 eine Rolle spielen, zeigten dabei eine signifikante Regulation unter niedrig dosierter Proteasominhibition. Zusammengefasst tragen die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse dazu bei, einen detaillierten Überblick über die initialen Prozesse niedrig dosierter Proteasominhibition in Endothelzellen zu geben. Die Daten deuten dabei auf eine schnelle Adaptation der Zellen nach partieller Proteasomhemmung mittels Aktivierung einer anti-oxidativen Stressantwort sowie durch Regulation von Splicingvorgängen hin, die letztendlich in einem veränderten Expressionsprofil der Endothelzellen münden. Mit diesem systematischen Ansatz und der Kombination von Proteom- und Transkriptomanalyse konnten dabei einzelne Targets für die Mediation einer protektiven zellulären Stressantwort nach partieller Proteasomhemmung identifiziert werden.The ubiquitin proteasome system (UPS) is the most important non-lysosomal proteolytic system for the degradation of intracellular proteins. The inhibition of the UPS is either able to induce apoptotic cell death in a dose dependent manner or start the induction of a protective stress response. Next to the effectiveness of proteasome inhibition in its therapeutic application exact knowledge of the way it acts is essential to better determine the primary effects of proteasome inhibition and better understand the initial effects that mediate the cellular response to proteasome inhibition. In this study, proteomic and transcriptomic methods were combined to characterize complex cellular changes of endothelial cells after proteasome inhibition. In addition, this study also seeked to identify the substrates that are stabilized in endothelial cells upon proteasome inhibition by means of immunoprecipitating polyubiquitinated proteins. Primary endothelial cells (Huvec) were chosen as the model system and treated with low and high doses of the proteasome inhibitor MG132. The expression profile of 2 and 6 hours of proteasome inhibition was determined using Affymetrix Chip analyses. Whole cell lysates were separated after 2 hours of proteasome inhibition using 2D gels and differential protein expression was visualised using silver staining. More than 20 regulated proteins were identified which were currently unknown in their contribution to a protective stress response after low does proteasome inhibition. By correlation with the in parallel performed expression arrays the regulation of those proteins was identified to be independent of transcription. The functional annotation of the data showed enrichment of proteins related to the cellular stress response, intracellular signal transduction and oxidative stress, which also reflected differences between low and high dose proteasome inhibition. While low doses of proteasome inhibitors showed a protective gene pattern, high dose inhibition induced apoptotic cell death. Also, dependent on the amount of proteasome inhibition, a clear incline of free oxidative radicals was detected pointing to the mediation of apoptosis due to free radicals. Additionally, with DJ-1, Peroxiredoxin-1 and -6 several proteins involved in the sensing of intracellular oxidative stress were identified. To identify next to the proteome and transcriptome analysis also specific substrates of proteasome inhibition as potential mediators of a protective stress response, whole cell lysates were separated using Ubiquitin immunoprecipitation and Ubiquitin-bound proteins were identified via mass spectrometry. Thereby a set of 22 proteins was identified which were specifically bound to the Ubiquitin matrix upon proteasome inhibition for 2 hours. The set included in particular RNA binding proteins, components of the UPS and ribosomal proteins. To specifically identify transcriptional mediators of the protective stress response after partial proteasome inhibition, a subproteome analysis with nuclear extracts of Huvec's was performed. After visualisation via DIGE labeling and quantitative evaluation 361 regulated spots were detected. Of those spots 319 were identified using MALDI-MS and 152 different proteins were allocated. The functional evaluation showed a clear over representation of RNA binding and splicing relevant proteins. In addition, it was possible to show a functional methylation of HnRNP A1, an RNA binding protein, coinciding with an altered subcellular location. These results point towards a differential regulation of cellular splicing events after partial proteasome inhibition. In parallel performed exon sensitive arrays more than 600 genes with differentially regulated exons were identified which especially code for genes with receptor and transport proteins. Also a raised number of genes with methyltransferase/kinase activity were identified. Especially the methyltransferases, which are involved in the posttranslational modification of HnRNP A1, showed a significant regulation upon low does proteasome inhibition. In conclusion, the results of the present study contribute to a more precise overview of the initial processes of low dose proteasome inhibition of endothelial cells. The data point to a rapid adaption of the cells in response to low dose proteasome inhibition by activation of an antioxidative stress response and by modulation of splice events, thereby contributing to an altered expression profile of endothelial cells. With this systematic approach and the combination of proteome and transcriptome analysis it was possible to identify single targets for mediation of a protective cellular stress response after partial proteasome inhibition