Die Regulation renaler Mrp-Tranporter bei der Ratte

Das Zusammenspiel von Transportproteinen in den Nieren, der Leber und im Intestinaltrakt ist notwendig für die effiziente Elimination von potentiell giftigen Metaboliten und die Erhaltung von essentiellen Metaboliten für den Organismus. Dabei spielen die Effluxmechanismen der Multidrug Resistance-related Proteine (Mrp) eine wichtige Rolle in der Absorption, Verteilung und Elimination von endogenen und xenobiotischen Substanzen. In den Epithelzellen des Nierentubulus sind Mrp2 (Abcc2) und Mrp4 (Abcc4) apikal exprimiert während sich Mrp3 (Abcc3) in der basolateralen Membran befindet. Die Rolle der Mrp-Transporter in der Regulation des zellulären Redoxstatus ist noch nicht aufgeklärt. Die systemische Mrp2-Defizienz induziert die mRNA-Expression antioxidativer Proteine in der Niere. Auch die Aktivität des sympathischen Nervensystems ist wichtig für die Nierenfunktion. Der Einfluss der renalen Innervation auf den Transport organischer Ionen ist bisher kaum untersucht. In der vorliegenden Arbeit sollte die Hypothese getestet werden, dass das sympathische Nervensystem einen Einfluss auf die Expression und Funktion der Mrp-Transporter hat. Zunächst sollte nach renaler Denervation von Lewisratten und kongenen Mrp2-defizienten Ratten die Transporterexpression und -funktion von Mrp2 und Mrp4 bestimmt werden. Weiterführend sollte als Modell für eine Nierenschädigung die 5/6-Nephrektomie nach drei bzw. sieben Wochen beschrieben und der Einfluss der renalen Denervation auf die Expression von Mrp2, Mrp3 und Mrp4 bestimmt werden. Ein anderer Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Rolle von Mrp2 bei der zellulären Redoxregulation unter nephrotoxischen Bedingungen. Es wurde die Hypothese getestet, dass die renale Mrp2-Defizienz eine akute CsA-induzierte Nephrotoxizität verstärkt. Die kongene Transplantation von Mrp2-defizienten Nieren auf Wildtypempfänger (Lewisratten) erzeugte eine isolierte renale Mrp2-Defizienz. Als Kontrollen dienten syngene Transplantationen unter Lewisratten. Die Tiere wurden für eine Woche mit CsA in einer immunsuppressiv wirkenden Dosis bzw. einer zusätzlich nephrotoxisch wirkenden Dosis oder mit einer Placebodiät behandelt. Zur Überprüfung der Hypothesen wurde die Transporterfunktion durch Clearance-Messungen und die Transporterexpression durch Real-time PCR, Western blot und Immunhistologie untersucht. Darüber hinaus charakterisierte ein PCR-Array das nephrotoxisch-veränderte Expressionsmuster. Außerdem wurden Enzymaktivitäten durch Lucigenin-verstärkte Chemilumineszenz und fotometrische Enzymaktivitätsassays sowie die Glutathionkonzentration fotometrisch ermittelt. Die renale Denervation ohne Reduktion der Nierenmasse hatte keinen Einfluss auf die Transporterexpression und -funktion von Mrp2 und Mrp4 in der Niere. Die 5/6-Nephrektomie führte zu erhöhten Mrp2- und Mrp4-mRNA-Gehalten und zu einem reduzierten Mrp3-Proteingehalt im renalen Kortexgewebe. Durch zusätzliche renale Denervation bei 5/6-Nephrektomie war der mRNA-Gehalt von Mrp3 signifikant erhöht. Bei 5/6-Nephrektomie war nach drei Wochen ein erhöhter Glutathionquotient als Indikator für oxidativen Stress im Nierengewebe messbar, der durch die renale Denervation signifikant reduziert wurde. Sieben Wochen nach der Denervation bei 5/6-Nephrektomie war die Expression und Lokalisation der Mrp-Transporter nicht verändert. Des Weiteren war zu diesem Zeitpunkt der renale Gesamtglutathiongehalt unabhängig von der renalen Denervation reduziert. Nach sieben Wochen vermehrt auftretende Hydronephrosen im Nierenkortex lassen sich als ein histologisches Anzeichen für einen Nierenschaden deuten. Die durch CsA-Behandlung höheren mRNA-Gehalte der UDP-Glucuronosyltransferase 1a6 und der Glutathionperoxidase 2 waren im Falle einer nierenspezifischen Mrp2-Defizienz zusätzlich erhöht. Dieser Effekt und auch der durch Mrp2-Defizienz erhöhte mRNA-Gehalt des Cytochroms 1a1 weisen auf eine erhöhte metabolische und oxidative Belastung im Transplantatgewebe durch das Fehlen von Mrp2 bei CsA-induzierter Nephrotoxizität hin. Durch die Behandlung mit CsA trat dosisabhängig ein erhöhter Glutathionquotient im Transplantatgewebe auf. Die nierenspezifische Mrp2-Defizienz führte nicht zu einem signifikant erhöhten Glutathionquotienten. Eine mögliche funktionelle Redundanz anderer renaler Transporter wie Mdr1 könnte den Effekt der Mrp2-Defizienz limitieren. In dieser Arbeit konnte eine mit oxidativem Stress assoziierte Abhängigkeit des mRNA-Gehalts des basolateralen Transporters Mrp3 vom sympathischen Nervensystem unter Reduktion der Nierenmasse nachgewiesen werden. Außerdem verstärkt die renale Mrp2-Defizienz nicht die akute CsA-induzierte Nephrotoxizität, was möglicherweise auf eine kompensatorische Induktion der Glutathionperoxidase 2, der UDP-Glucuronosyl-transferase 1a6 oder des renalen Transporters Mdr1 zurückgeht.In proximal tubular epithelial cells Mrp2 and Mrp4 are expressed in apical and Mrp3 in basolateral cell membranes. They contribute to the secretion of endogenous compounds and xenobiotics. In humans certain MRP2 genotypes are associated with increased susceptibility to drug toxicity. Information on the neurohormonal regulation of the transporters in rodent kidneys is sparse. At present there is no information on the contribution of renal sympathetic innervation to the expression and activity of Mrp2, Mrp3 and Mrp4. The hypothesis was tested that the expression of Mrp2 and Mrp4 in the kidney is regulated by the sympathetic nervous system at basal conditions and in an experimental rat model in which increased oxidative stress is apparent. Furthermore, the hypothesis was tested that kidney-specific deletion of Mrp2 increases CsA-induced kidney graft toxicity through increased oxidative stress. At first, we denervated kidneys from Lewis rats and congenic Mrp2-deficient rats to exclude an effect of the sympathetic system on basal conditions. Furthermore, Lewis rats underwent 5/6-nephrectomy with denervation or sham operation of the remnant kidney for three or seven weeks. Uninephrectomized rats served as controls. To assure the integrity of the remnant/remaining kidney we measured creatinine levels in the plasma. Total and oxidized glutathione and the transporter expression (Real-time RT PCR, Western Blot analysis) in the cortical tissue of the kidneys were measured. Furthermore, kidney-specific deletion of Mrp2 was achieved by renal cross transplantation between congenic wild-type and Mrp2-deficient rats followed by removal of both native kidneys. In controls syngenic transplantations were performed. Animals were treated with CsA at 10mg/kg or 30mg/kg for one week. Renal cortical oxidative stress was assessed by biochemical and gene expression analyses and the measurement of total and oxidized glutathione. Enzyme activities of antioxidant and superoxide-forming enzymes were analysed. Three weeks after 5/6-nephrectomy, the ratio of oxidized to total glutathione, indicating the extent of oxidative stress, was increased due to 5/6-nephrectomy comparing with uninephrectomy and denervation of the kidney decreased the ratio approximately back to levels of uninephrectomized kidneys. After seven weeks, total glutathione was a decreased due to 5/6-nephrectomy. The mRNA expression (not protein expression) of Mrp2 and Mrp4 was increased due to 5/6-nephrectomy after three weeks. Denervation of the kidney has no effect on the expression of both transporters. The protein expression of Mrp3 decreased due to 5/6-nephrectomy after three weeks. Denervation of the kidney increased the mRNA expression of renal Mrp3 in 5/6-nephrectomized rats. After seven weeks, there was no effect on the transporter expression at all. CsA leads to increased renal GSH oxidation in transplanted kidney. A PCR array showed differential cortical expression of genes coding for enzymes involved in phase I biotransformation and antioxidant defence between placebo and CSA-treated animals. Two of these genes (glutathione peroxidase 2 and UDP-glucuronosyltransferase 1a6) showed a increased expression in Mrp2-deficient vs. wild-type grafts. CsA had no effect on xanthine oxidase (XO)-dependent superoxide formation and dose-dependently decreased superoxide formation by NADPH oxidases (NOX). To conclude, reduced oxidative stress after renal denervation of 5/6-nephrectomized rats doesn’t have an effect on the expression of the apical transporters Mrp2 and Mrp4, but increased mRNA expression of Mrp3 in 5/6-nephrectomized rats. Furthermore, renal Mrp2 is not critical for CsA toxicity in rat kidney grafts. Increased renal GSH oxidation in response to CsA may result from increased mitochondrial superoxide formation or accumulation of electrophilic substances other than reactive oxygen species