Analyse des Wirtszellproteoms und der Expression viraler Proteine in virusinfizierten Gewebekulturen durch quantitative Massenspektrometrie mit metabolisch eingeführten stabilen Isotopen

Zur Aufklärung der molekularen Grundlagen einer Infektion mit dem Pseudorabiesvirus (PrV), dem Erreger der Aujeszky’schen Krankheit beim Schwein, wurde eine qualitative und quantitative Proteomstudie von PrV-infizierten bovinen Nierenzellen (MDBK) durchgeführt. Die Erstellung der Proteomkarten erfolgte durch hochauflösende zweidimensionale Gelelektrophorese, mit der neben zum größten Teil unmodifizierten Proteinen auch eine Reihe von Proteinen mit posttranslationalen Modifikationen nachgewiesen werden konnten. Die Identifizierung der Proteine erfolgte mit dem Peptidmassenfingerabdruck durch Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-of-Flight(MALDI-TOF)-Massenspektrometrie. Proteine wurden massenspektrometrisch durch die stable isotope labelling by amino acids in cell culture (SILAC)-Technik quantifiziert. Um die Komplexität des Gesamtzellextraktes zu reduzieren, wurde eine Affinitätsfestphasenchromatographie aus verschiedenen Matrices, bestehend aus einer Cibacron Blau F3G-A Matrix, die Nukleotid-bindende Proteine bindet, einer Heparin Matrix, die DNA-bindende Proteine bindet und einer Phosphoprotein spezifischen Metallchelatmatrix etabliert. Dabei zeigte sich, dass sich der Gesamtzellextrakt in gut definierte Teilproteome fraktionieren ließ. Die Fraktionierung zeichnete sich durch eine hohe Trennschärfe, eine hohe Effizienz und eine spezifische Anreicherung entsprechend der Affinitäten der verwendeten Matrices aus. Zur weiteren Erhöhung der zu analysierenden Proteine wurden die Fraktionen auf mehreren Fokussierungsstreifen mit unterschiedlichen pH-Wert Bereichen (3-6, 4-7, 6-9 und 3-10) analysiert, wobei sich lediglich der pH-Bereich zwischen 3-6, als relativ proteinarm erwies. Die Streuung bezüglich der relativen Quantifizierung wurde in einem Kontrollversuch bestimmt. Sie war sehr gering, was auch die Erfassung sehr kleiner Unterschiede in den Expressionsniveaus erlaubt. Das bovine Wirtszellproteom erwies sich vier Stunden nach Infektion mit dem PrV in qualitativer und quantitativer Hinsicht, trotz des beschriebenen shutoff, der zu einem Abbau der zellulären mRNA führt, als überraschend stabil. Quantitative Unterschiede wurden bei 109 Wirtszellproteinen gefunden. Vorwiegend handelte es sich dabei um Proteine der Kernlamina, Bestandteile des Translationsapparates, Proteine des Membran- und intrazellulären-Transports, sowie Proteine der Stressantwort. Bei den Proteinen Lamin A/C und B2, 60S Saures Ribosomale Protein P0, Hitzeschock-27 Protein 1, Heterogenes Nukleäres Ribonukleoprotein K, Sorting Nexin-9 und dem Eukaryotischen Translations-Initiations Faktor 4B wurden Mengenverschiebungen zwischen den Isoformen hin zu den stärker negativ geladenen Varianten beobachtet, die möglicherweise auf Phosphorylierungen zurückzuführen sind. Um den Mechanismus der Regulation der Wirtszellproteinexpression genauer zu untersuchen, wurde aufbauend auf den Ergebnissen der Proteomstudie eine Transkriptanalyse durchgeführt. Transkriptom- und Proteom-Analysen nach einer PrV-Wildtyp-Infektion zeigten eine nur geringe Korrelation, sodass die beobachteten Veränderungen der Proteinmengen die Folge von posttranslationalen Vorgängen sein dürften. Neben der Quantifizierung von Wirtszellproteinen wurde die SILAC-Methode zur Quantifizierung der Expression von viralen Proteinen in Deletionsmutanten getestet. Dazu wurde der Analysengang verändert und MDBK-Zellen mit einer PrV-US3-Deletionsmutante (PrV-ΔUS3) und dem PrV-Wildtyp infiziert. Die Extrakte aus PrV-Wildtyp-infizierten Zellen wurden als globaler interner Standard verwendet. Die Verwendung der SILAC-Methode erlaubte hier die Anwendung der sonst sehr Artefakt-anfälligen Zellfraktionierung in Zytosol- und Kernextrakte zur Reduktion der Probenkomplexität. Ein Vergleich zur Affinitätsfestphasenextraktion zeigte, dass ein Großteil der identifizierten Proteine auch mit letzterer erfasst wird. Einige wichtige Kernproteine wie Spleißfaktoren konnten aber nur in der Kernfraktion identifiziert werden. Vergleiche von Zellextrakten nach Infektion mit PrV-Wildtyp oder einer US3-negativen Mutante zeigten Veränderungen in den Expressionsniveaus der viralen Proteine pUL29, pUL39 und pUL42. Dabei besaßen pUL29 und pUL39 eine erhöhte und pUL42 eine verminderte relative Abundanz in Abwesenheit des pUS3. Die Proteine pUL29 und pUL42 traten in mehreren Ladungsvarianten auf, wobei das pUL42 zusätzlich eine Größenvariante aufwies. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde ein SILAC-gestütztes Verfahren zur Quantifizierung der Expression von Fremdgenen in viralen Vektoren etabliert.To elucidate the molecular basis of an infection by pseudorabies virus (PrV), the etiological agent of Aujeszky's disease in pigs, a qualitative and quantitative proteome study of PrV-infected bovine kidney cells (MDBK) was performed. Proteome maps were generated by high-resolution two-dimensional gel electrophoresis. A number of proteins with post-translational modifications were identified in addition to the majority of unmodified proteins. Proteins were identified by peptide mass fingerprint analysis using matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. Quantitation was carried out by mass spectrometry using the SILAC (stable isotope labeling by amino acids in cell culture) technique. Affinity solid-phase extraction (ASPE) with matrices specific for nucleotide-binding proteins (Cibacron Blue F3G-A), DNA and RNA-binding proteins (heparin) and phosphoproteins (a metal chelate matrix) was applied to reduce the complexity of whole cell extracts. ASPE was found to efficiently fractionate the extract into well-defined subproteomes with high selectivity and excellent accordance with the binding-specificities of the matrices used. To further enhance yields of identified proteins, fractions were analyzed on focusing strips with different pH ranges (3-6, 4-7, 6-9 and 3-10). Protein yields in the pH range between 3 and 6 were low. The variance of the procedure with respect to quantitation, which was estimated in a separate control experiment, was very low so that even small differences in the relative expression levels could be reliably detected. Four hours after infection with PrV the bovine host cell proteome was found to be surprisingly stable in spite of the viral shutoff mechanism which leads to degradation of cellular mRNA. Significant changes in relative levels were found for only 109 host cell proteins, most of them being constituents of the nuclear lamina, components of translation machinery, proteins involved in membrane and intracellular transport, and stress proteins. For the proteins lamin A/C and B2, 60S acidic ribosomal protein P0, heat shock-27 protein 1, heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K, sorting nexin-9 and eukaryotic translation initiation factor 4B an increase of the more negatively charged forms at the loss of the more basic variants was observed, which may be the result of phosphorylations induced by PrV-infection. To further investigate the mechanisms of regulation of the host cell protein expression in PrV-infected cells, a microarray study was performed with mRNA isolated from PrV-infected cells and compared to the results of the proteome study. Transcriptome and proteome analysis of PrV-infected MDBK cells showed only poor correlation, indicating that the observed changes in protein levels are most likely to result from posttranslational events. The SILAC-approach was also applied to quantitate expression levels of viral proteins in cells infected with deletion mutants. To that purpose, MDBK cells were infected with a mutant not expressing the viral kinase pUS3 (PrV-ΔUS3) or with PrV wild-type. In these experiments, extracts from PrV wild-type-infected cells were used as global internal standard. The introduction of the standard at a very early stage of the experiment allowed the application of cell fractionation protocols, which otherwise are very prone to produce isolation artefacts that hamper exact quantitation. Thus, cells were fractionated into a nuclear and a cytosolic fraction, which were then analysed by two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry. The more tedious ASPE procedure described above was shown to allow a more comprehensive analysis than the cell fractionation protocol, although a number of important nuclear proteins such as splicing factors escaped the analysis by ASPE and were only detected and quantitated after cell fractionation. Comparison of cell extracts after infection with PrV wild-type or a US3-negative mutant revealed hitherto unknown changes in expression levels of the viral proteins pUL29, pUL39 and pUL42. While levels of pUL29 and pUL39 were increased, the level of pUL42 was decreased in the absence of pUS3. Proteins pUL29 and pUL42 appeared in several charge variants, and pUL42 in an additional variant with slightly reduced molecular weight. In the third part of this study, a SILAC-based approach to quantitate expression levels of foreign genes in viral vectors has been established