Untersuchungen zur Expression und Funktion der Transportproteine MRP4 (ABCC4), MRP5 (ABCC5) und hENT1 (SLC29A1) in der Hämatopoese und deren Bedeutung bei der Behandlung der AML

Hämatopoetische Stammzellen und zahlreiche reife periphere Blutzellen exprimieren Effluxtransporter vom ABC-Typ, darunter auch die Vertreter MRP4 und MRP5. Weiterhin sind Nukleosidtransporter wie hENT1 in vielen Blutzellen nachgewiesen worden. Über die Regulation dieser an der Vermittlung von Zytostatikaresistenzen beteiligten Transporter im Verlauf der hämatopoetischen Differenzierung ist bisher nur wenig bekannt. Um diesen Prozess genauer zu studieren, wurden zunächst CD34-postive Blutzellvorläufer aus Nabelschnurblut und reife Monozyten und Granulozyten aus peripherem Blut isoliert und hinsichtlich ihrer Transporterexpression charakterisiert. Anschließend wurden die leukämischen Modellzelllinien HL-60, U-937 und M-07e in vitro zur myelomonozytären beziehungsweise megakaryozytären Differenzierung angeregt und die Expression, Lokalisation und Funktion von MRP4, MRP5 und hENT1 während dieses Vorgangs per Real-Time PCR, Western Blot, Immunfluoreszenzmikroskopie und Zytotoxizitäts-Assay untersucht. Der Erfolg der Differenzierung wurde durchflusszytometrisch mittels spezifischer Oberflächenmarker überprüft. Es konnte gezeigt werden, dass MRP4, MRP5 und hENT1 in CD34-positiven hämatopoetischen Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut sowie in reifen Monozyten und Granulozyten exprimiert sind. In den Progenitorzellen konnte eine signifikant höhere MRP4-Expression als in den reifen Blutzellen gefunden werden. Dementsprechend ging auch die modellhafte myelomonozytäre Differenzierung der Zelllinien HL-60 und U-937 mit einer signifikanten Reduktion der MRP4-Expression einher. Im Zuge der megakaryozytären Ausreifung der Zelllinie M-07e hingegen konnte ein signifikanter Anstieg der MRP4-Expression beobachtet werden. Die hENT1-Expression war nach Induktion von Differenzierung signifikant vermindert. Weiterhin konnte nach Induktion von Differenzierung eine signifikante Veränderung der Sensitivität gegenüber 6-Mercaptopurin und Cytarabin beobachtet werden. MRP5 blieb unter Differenzierungsbedingungen im Wesentlichen unverändert. Die Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass insbesondere MRP4 im Zuge der hämatopoetischen Differenzierung spezifisch reguliert wird. Der beobachtete Anstieg während der Megakaryopoese unterstützt die Vorstellung einer Beteiligung von MRP4 bei der Thrombozytenfunktion. Weiterhin scheint sich die Expression von MRP4 und hENT1 im Zuge der myelomonozytären Differenzierung zu verringern, was sich auch in Resistenzveränderungen gegenüber 6-Mercaptopurin und Cytarabin niederschlägt. Diese Effekte sollten bei der Entwicklung von neuen Therapieschemata zur Behandlung einer AML berücksichtigt werden, falls eine Applikation von Differenzierungsagenzien in Kombination mit konventionellen Zytostatika vorgesehen ist.Hematopoietic stem cells and many mature blood cells express ABC-type efflux transporters, such as MRP4 and MRP5. Furthermore, nucleoside transporters like hENT1 have been detected in many blood cells as well. Only little is known about the regulation of these transporters, which confer resistance to cytotoxic drugs, during hematopoietic differentiation. To study this process in more detail, expression of these transporters was investigated in cord blood-derived hematopoietic progenitor cells expressing CD34 and mature monocytes and granulocytes, gained from human venous blood. Moreover, the leukemia cell lines HL-60, U-937 and M-07e were induced to differentiate towards the myelomonocytic and the megakaryocytic lineage, respectively. Differentiation status was determined by flow cytometry using lineage-specific surface markers. Expression, localization and function of MRP4, MRP5 and hENT1 were assessed by means of real-time PCR, western blotting, immunostaining and cytotoxicity assay. MRP4, MRP5 and hENT1 were found to be expressed in cord blood-derived hematopoietic stem cells as well as in monocytes and granulocytes. MRP4 expression was significantly higher in the progenitor cells than in the mature blood cell populations. In addition to this finding, myelomoncytic differentiation resulted in a reduced expression of MRP4, whereas megakaryocytic differentiation led to an increased expression of MRP4. hENT1 was found to decrease when differentiation was induced, especially when leukemia cell lines were incubated with the differentiation inducing agent All-trans-retinoic acid (ATRA). Interestingly, differentiation was accompanied by significant modifications of the cytotoxicity of 6-mercaptopurine and cytarabine. Expression of MRP5 was not altered by induction of differentiation. The results indicate that MRP4 is specifically regulated during hematopoietic differentiation. The increased expression during megakaryocytic differentiation supports the notion of a role of MRP4 in platelet mediator storage. The finding that induction of differentiation affects transport protein expression and sensitivity to cytotoxic drugs should be considered when differentiation inducing agents, such as ATRA, are applied in addition to cytostatic drugs