In vitro-Modell zur Charakterisierung transportvermittelter biliärer Ausscheidung

Im Laufe der letzten Jahre hat sich herausgestellt, dass Transportproteine einen entscheidenden Beitrag zur Absorption, Verteilung und Elimination zahlreicher Endo- und Xenobiotika leisten. Vor allem die hepatobiliäre Elimination nimmt eine Schlüsselrolle in systemischen Clearance-Prozessen ein. Vor dem Hintergrund, dass immer mehr hochmolekulare und metabolisch stabile Stoffe Eingang in die Arzneistoffentwicklung finden und diese vorwiegend hepatobiliär eliminiert werden, wurde es erforderlich, differenziertere Kompartimentmodelle zu entwickeln, um singuläre Substanzeffekte auf zellulärer Ebene zu untersuchen. Gerade Interaktionen zwischen simultan verabreichten Arzneistoffen können zu erheblichen Nebenwirkungen durch Veränderung pharmakokinetischer Eliminationsprozesse in Kombination mit erhöhter oder eingeschränkter Bioverfügbarkeit führen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, für die frühe Arzneistoffentwicklung ein In vitro-Modell auf Basis des pharmakokinetischen Standardtiermodells der Ratte zu konzipieren, welches eine einfache Analyse hepatobiliärer Elimination auf indirektem Weg über die Interaktion mit fluoreszierenden Modellsubstraten ermöglicht. Die Zielvorgabe wurde umgesetzt, indem auf Basis literaturbeschriebener Methoden ein In vitro-Rattenhepatozytenmodell etabliert wurde. Hierfür war es zunächst unerlässlich, geeignete Kultivierungsbedingungen zu identifizieren und zu optimieren. Es konnte gezeigt werden, dass primäre Hepatozyten nur befähigt wurden, sich in vitro zu repolarisieren und eine in vivo-ähnliche Morphologie anzunehmen, wenn sie eingebettet zwischen zwei extrazellulären Kollagenmatrices kultiviert wurden. Diese sogenannte Sandwichkultivierung der Zellen und die Supplementierung des Zellkulturmediums mit dem Glukokortikoid Dexamethason erwiesen sich hierfür als wesentliche Faktoren. Die Hepatozyten reformierten sich folglich innerhalb von 96 Stunden unter Ausbildung eines vollständigen und sehr einheitlichen Gallengangssystems, welches nahezu jeden Hepatozyten umschloss. Nach Etablierung der Zellkultur wurden die sandwichkultivierten Hepatozyten hinsichtlich der Proteinexpression, ausgewählte Transportproteine und Cytochrome umfassend, über einen Kultivierungszeitraum von 10 Tagen charakterisiert, um die Validität des Zellsystems zu gewährleisten. Unter Bei-behaltung der optimierten Kultivierungsbedingungen konnte mit zunehmendem Repolarisierungsstatus der Zellen ein Anstieg der apikalen Transportproteinexpression unter Begleitung einer Erhöhung der molekularen Masse der Transportproteine verzeichnet werden. Als Grund für die Molekulargewichtszunahme im Laufe des Redifferenzierungsprozesses der Zellen konnte die posttranslationale N-Glykosylierung am Beispiel der Transportproteine P-gp, Mrp2 und Bcrp identifiziert werden. Verifiziert wurden die Proteinexpressionsdaten, die apikalen Effluxtransporter P-gp, Mrp2, Bsep und Bcrp betreffend, über die Bestimmung der funktionellen Aktivität unter Verwendung fluoreszierender Modellsubstrate über einen Kultivierungszeitraum von 8 Tagen. Diese funktionelle Aktivität der Transportproteine wurde durch das Erscheinen fluoreszierender Moleküle in den Lumina der Gallenkanälchen ersichtlich und nahm mit voranschreitender Maturierung des Gallenkanalnetzwerkes sowie mit Verstärkung der Transportproteinexpression, gekoppelt mit dem Grad der N-Glykosylierung, zu. Die Selektivität der einzelnen Modellsubstrate wurde mittels in der Literatur beschriebener Substrate und Inhibitoren untersucht und bestätigt. Auf Basis der funktionellen Charakterisierung wurde im Anschluss eine indirekte In vitro-Methode entwickelt, welche die Voraussetzung schuf, Interaktionspotentiale von Arzneistoffen mit Effluxtransportproteinen zu evaluieren. Die Inhibition eines apikalen Transportproteins resultierte dabei prinzipiell in Abhängigkeit der eingesetzten Substanzkonzentration in einer Reduktion des eliminierten fluoreszierenden Modellsubstratanteils, was mit einer Zunahme der intrazellulären Fluoreszenz korrelierte. So konnte aufgezeigt werden, dass bekannte Inhibitoren und Substrate die Transport-proteinaktivität konzentrationsabhängig reduzierten, ohne dass der sichtbare Effekt auf toxische Effekte der eingesetzten Substanzen zurückzuführen war. Dies konnte mittels des Zelltoxizitätsmarkers Alamar blue nachgewiesen werden. Clonidin, welches nicht als ABC-Transportersubstrat beschrieben worden ist, interagierte erwartungsgemäß auch mit keinem der Transportprozesse. Der Einsatz eines derartigen In vitro-Systems in der frühen Arzneistoffentwicklung könnte helfen, geeignete Arzneistoffkandidaten auszuwählen, welche ein geringes Potential aufweisen, mit hepatobiliären Effluxsystemen zu interagieren, um die Gefahr schwerer Arzneimittelnebenwirkungen zu minimieren.The liver plays a predominant role in the elimination of exogenous and endogenous substances from blood. Elimination occurs via metabolic degradation and/or excretion into bile. Hepatic transport proteins, anchored to the membranes of the basolateral and apical membrane of the hepatocytes, are critical and selective components of this elimination machinery. Uptake trans-porters at the basolateral site are necessary for inward transport, whereas for outward transport into the bile canaliculi hepatic efflux transporters, located at the cancalicular site, are responsible. ATP-binding cassette (ABC) transport proteins mainly coordinate this efflux transport. The most widely involved ABC transporters are the P-glycoprotein (P-gp/MDR1/ABCB1), the mul-tidrug resistance associated protein 2 (MRP2/ABCC2), the breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) and the bile salt export pump (BSEP/ABCB11). The aim of this PhD work was to design and to characterize an in vitro system which enables an easy analysis of hepatobiliary excretion by using primary rat hepatocytes. In the context of this work it could be shown that rat hepatocytes re-polarize and adopt physiological morphology if cultured between extracellular matrices, e. g. 2 layers of collagen (sandwich cultivation). Fur-thermore it turned out that the glucocorticoid dexamethasone is an important factor for cell re-differentiation. Re-differentiation of rat hepatocytes was observed within 5 days of culturing. At this time point, sandwich-cultured hepatocytes were completely re-polarized and demonstrated an extensive canalicular network. For biochemical characterization, sandwich-cultured hepatocytes cultured over different time periods were analyzed regarding protein expression of selected uptake and efflux transporters as well as cytochromes. It could be shown that re-differentiation of hepatocytes was associated with alterations in protein expression as well as with an increase in N-glycosylated isoforms of the ABC transporters P-gp, Mrp2 and Bcrp. For functional characterization of the transport proteins P-gp, Mrp2, Bsep and Bcrp, specific fluorescent model substrates were used. It could be shown that the ABC transporters regained their functional activity during prolonged cultivation which was reflected by an increased excretion of fluorescent dye into bile canaliculi. Using the fluorescent model substrates, an in vitro method was established to evaluate drug-interactions with the ABC transport proteins P-gp, Mrp2, Bsep and Bcrp. Therefore, the selectivity of the fluorescent model substrates was examined and confirmed via a set of different well described substrates and inhibitors. The principle of this assay is based on visible alterations in disposition behaviour of a fluorescent model substrate in the presence of a test compound. Interaction of the compound with the ABC transporter results in the intracellular accumulation of the respective fluorescent model substrate and, concomitantly, in a decrease of fluorescence in bile canaliculi. The extent of excretion and/or intracellular accumulation reflects the inhibitory potential of the test compound. In summary, the sandwich-cultured rat hepatocyte model, established within the scope of this PhD work, is applicable to evaluate the interaction potential of drug candidates with hepatobiliary efflux transport systems