Neue Konzepte für das Protein-Engineering am Beispiel von Enzymen mit alpha/beta-Hydrolasefaltung

Trotz einer sehr großen funktionellen Diversität, zeichnen sich die Enzyme innerhalb der α/β-Hydrolasefaltung-Superfamilie durch eine sehr hohe strukturelle Homologie aus, weshalb man annimmt, dass sich deren Vertreter über divergente Evolution aus einem gemeinsamen Vorfahren entwickelt haben. Unter Zuhilfenahme von Methoden des Protein-Engineerings sollte im ersten Teil der Arbeit untersucht werden, ob es möglich ist, Enzyme innerhalb dieser Superfamilie ineinander umzuwandeln. Als Modelenzyme dienten eine Esterase aus Pseudomonas fluorescens (PFE) und eine Epoxidhydrolase aus Agrobacterium radiobacter (EchA). Nach der Etablierung geeigneter Analysemethoden für Esteraseaktivität und Epoxidhydrolaseaktivität wurden mittels verschiedener Sequenz- und Strukturalignments Aminosäuren identifiziert, die essentiell für den jeweiligen Reaktionsmechanismus sind. Diese wurden nachfolgend mittels positionsgerichteter Mutagenese in die jeweiligen Enzyme eingefügt und die entsprechenden Mutanten auf die jeweilige Aktivität hin untersucht. Leider zeigte weder die PFE Epoxidhydrolaseaktivität, noch die EchA Esteraseaktivität. Anschließend wurden über weitere Strukturvergleiche ganze Bereiche in Epoxidhydrolasen identifiziert, die möglicherweise von Wichtigkeit für die Funktionalität des Enzyms sind. Es wurden also ganze Bereiche der PFE durch solche der EchA ersetzt und auf diese Weise drei Chimär-Enzyme hergestellt. Diese Chimären wurden mittels Coexpression von Chaperonen hergestellt und anschließend aufgereinigt. Eines dieser Chimärenzyme zeigte eindeutig Epoxidhydrolaseaktivität. Es wird angenommen, dass der Eingangsbereich ins aktive Zentrum der PFE im Wildtyp-Enzym versperrt war und dieser durch den Austausch eines Loops geöffnet wurde. Weiterhin wurde ein Ansatz entwickelt, Esteraseaktivität in der EchA zu generieren. Dieser basiert auf einem strukturbasierten Sequenzalignment, das es erlaubt Aminosäuren zu identifizieren, die sich in Epoxidhydrolasen und Esterasen unterscheiden. Leider führte dieser Ansatz bisher noch nicht zum Erfolg, weshalb weitere Untersuchungen nötig sind. Im zweiten Teil der Arbeit ging es darum, Mutantenbibliotheken für die fokussierte, gerichtete Evolution möglichst klein, aber qualitativ hochwertig herzustellen. Zu diesem Zweck wurde ebenfalls ein strukturbasiertes multiples Sequenzalignment herangezogen, das es erlaubt die Aminosäureverteilung an verschiedenen Positionen des Enzyms in einer riesigen Anzahl strukturell verwandter Enzyme zu bestimmen. Auf diese Weise kann ermittelt werden, welche Aminosäuren an definierten Positionen sehr häufig sind und welche eher selten. Von solchen Resten, die sehr selten sind, wird angenommen, dass sie negative Auswirkungen auf die strukturelle Integrität des Proteins haben und deshalb von der Natur nicht berücksichtigt wurden. Diese Annahme wurde zur Herstellung von Proteinbibliotheken ausgenutzt. In einer fokussierten, gerichteten Evolution wurden einmal 3 und einmal 4 Aminosäuren der PFE simultan und zufällig durch Aminosäuren ersetzt, die sehr häufig in 2800 verwandten Sequenzen an diesen Positionen vorkommen. Die auf diese Weise generierten Bibliotheken wurden einmal auf eine verbesserte Thermostabilität (für die 3 Positionen) und einmal auf eine verbesserte Enantioselektivität untersucht (4 Positionen). Hierbei wurde zusätzlich die Auswirkung der Mutationen auf die Substratspezifität untersucht. Als Vergleichsbibliotheken wurden ebenfalls einmal alle 20 proteinogenen Aminosäuren eingefügt und einmal nur solche, die sehr selten im Alignment auftauchen. Das Ergebnis war in beiden Fällen eine sehr viel bessere Bibliothek, wenn nur solche Reste vertreten waren, die auch in der Natur bevorzugt vorkommen. Dies galt sowohl in Bezug auf die Anzahl aktiver Klone in jeder Bibliothek, als auch auf die Chance eine verbesserte Variante zu finden (stabiler bzw. selektiver). Die besten Mutanten der Bibliotheken hatten im Vergleich zum Wildtyp einen 8°C höheren Schmelzpunkt bzw. einen bis 18fach höheren E-Wert (bei 50facher katalytischer Effizienz). Weiterhin konnten die Substratspezifität um den Faktor 4.300 verändert werden.Despite a very high functional diversity within the α/β-hydrolase fold superfamily the enzymes within that class show very high structural homology. Due to that fact it is believed that they developed from a common ancestor by divergent evolution. By using different methods of protenengineering, members of that family should be converted into each other. As model enzyme an esterase from Pseudomonas fluorescens and an epoxide hydrolase from Agrobacterium radiobacter were used. After establishment of sufficient analytical tools to measure epoxide hydrolase activity and esterase activity, respectively, sequence and structural alignments were performed in order to identify amino acids that are essential to the corresponding reaction mechanism. The mutations have been incorporated by site-directed mutagenesis and the mutants have been investigated towards the new activity. Unfortunately, none of the enzymes showed the desired function. Afterwards, there were performed further structural analysis to identify secondary elements which might be important to the activity. There were substituted whole segments of the PFE by those of the EchA. After coexpression with chaperones the enzymes were purified and analyzed. One of these chimeras was proved to have clear epoxide hydrolase activity. It is believed that the entrance to the active site of PFE was blocked by a loop. By replacing that loop the entrance could be opened allowing a functional conversion. Furthermore, an approach was developed for converting the EchA into an esterase. Therefore a structure-based multiple sequence alignment was applied allowing the identification of key residues of esterases and epoxide hydrolases. Unfortunately, it was not possible to detect any esterase activity so far. In the second part of the thesis the focus was on the generation of small mutant libraries that should be of improved quality. Again, there was applied an structure-based multiple sequence alignment that allows the determination of the amino acid distribution on certain enzyme position within a huge number of structurally related enzymes. By doing so, amino acids could be separated to rare or common. Rarely appearing amino acids are believed to have negative influences to the overall integrity of the protein. Due to that fact nature did not take then into consideration. In a focused directed evolution experiment there were replaced 3 or 4 amino acids, respectively, by only those residues that appear frequently on these positions in 2800 related sequences. The resulting libraries have been screened towards an improved thermostability (3 positions) and enantioselectivity (4 positions). In the latter case the library has furthermore been screened towards a change in substrate specificity. For comparison, libraries were constructed that carried either all 20 proteinogenic amino acids or those that are rarely in the alignment. The outcome was in both cases a substantially improved protein library regarding the ratio of active mutants and the chance to find variants with improved targeted property. The best mutants showed a melting temperature that is 8°C higher than the wildtype or an 18fold increased E-value, (while increasing the catalytic efficiency of about 50fold). Furthermore the substrate specificity was changed by a factor of 4.300