Die Expression der ABC-Transporter MRP4 und MRP5 in den hämatopoetischen Vorstufen der myeloiden Reihe

Viele periphere Blutzellen exprimieren ABC-Transporter an ihrer Zelloberfläche. Insbesondere konnten ABCC4 (MRP4) und ABCC5 (MRP5), die in Plasmamembranen verschiedener peripherer Blutzellen identifiziert wurden, spezifische Funktionen für die entsprechenden Zellpopulationen, wie z.B. die Mediatorspeicherung in den dichten Granula der Thrombozyten zugewiesen werden. Alle reifen Blutzellen stammen von derselben Stammzelle ab, sodass man annehmen muss, dass sich die spezifische Funktionalität und die dazugehörige zelluläre Ausstattung erst im Verlauf der Differenzierung ausbilden. Inwiefern sich diese Prozesse während der Differenzierung auf die Expression und Lokalisation von MRP4 und MRP5 auswirken, wurde bisher nicht untersucht. So wurde im Rahmen dieser Arbeit ein Zellmodell zur Isolierung CD34-positiver hämatopoetischer Stammzellen aus Nabelschnurblut entwickelt. Dies beinhaltete zudem die Behandlung CD34-positiver Zellen mit bestimmten Wachstumsfaktoren zur Differenzierung in die thrombozytäre und die myelomonozytäre Richtung. Darüber hinaus wurden die Leukämiezelllinien K562 und HL60 mit PMA, DMSO und Butyrat ausdifferenziert. Erstere in Richtung Thrombozyten, letztere in Richtung Makrophagen, Granulozyten und Monozyten. Der Differenzierungsnachweis wurde mittels FACS-Analyse geführt und die Expression von MRP4 und MRP5 im Anschluss auf mRNA und Protein-Ebene, mittels Real-Time PCR, Immunhistochemie, Western Blot und Akkumulationsassay erforscht. In den thrombozytär differenzierten CD34-positiven Zellen fand sich ein signifikant positiv korreliertes Verhältnis von MRP4 zu CD41a (Glykoprotein IIb/IIIa), hingegen eine negative Korrelation von MRP5 zu CD41a. Außerdem konnte im Laufe der Differenzierung in der Immunfluoreszenz eine zunehmende intrazelluläre Expression von MRP4 und eine Kolokalisation mit LAMP-2, einem Lysosomen- und Dense-Granula-Marker, gezeigt werden. Die myelomonozytären Zellen wiesen eine signifikante Reduktion an MRP4 und ebenfalls eine Verminderung der MRP5-Expression auf. In der Differenzierung der leukämischen Zelllinien wurde eine generelle Zunahme von MRP4 und MRP5 mit der Entdifferenzierung der Zellen in allen Linien gefunden. Die komplexen Vorgänge im Verlauf der menschlichen Hämatopoese umfassen also auch Veränderungen an MRP4- und MRP5-Expression in Qualität und Quantität. Sowohl in der physiologischen als auch in der pathologischen Zellentwicklung findet sich eine Regulation dieser beiden Transporter. Die Ergebnisse der Arbeit stützen die Annahme, dass MRP4 eine wichtige Rolle im Metabolismus der Thrombozyten spielt, hier besonders in der Speicherung und Freisetzung von cGMP, ADP und Serotonin. Die Transporterexpression in den Leukämiezelllinien steigt mit der Entdifferenzierung der Zellen. Aus dieser Erkenntnis ergeben sich therapeutische Überlegungen, Differenzierungsagenzien zur Überwindung der Multi-Drug-Resistenz mit Chemotherapeutika zu kombinieren.Many peripheral blood cells express ABC-transporters on their surface. Especially for MRP4 and MRP5, identified on plasma membranes of several peripheral blood cells, different specific tasks were found, e.g. mediator storage in thrombocytic dense granules. All mature blood cells derive from the same stem cell, so the different cell functions and the specific equipment are thought of to be developed during differentiation. The impact of these processes on expression and localization of MRP4 and MRP5 has not been investigated yet. Here, a cell modell was established for isolation of CD34 positive hematopoietic stem cells from cord blood. Separation was followed by differentiation towards the myelomonocytic and thrombocytic lineage with growth factors. Moreover, leukemic cell lines, HL60 and K562, were differentiated with PMA, DMSO and Butyrate towards granulocytes and megakaryocytes, respectively. Differentiation was proved by FACS-analysis and expression and localization of MRP4 and 5 was investigated using real-time PCR, immunostaining, western blotting and an accumulation assay. A significant positive correlation of MRP4-expression and CD41a-positivity (glycoprotein 2b/3a) was found in the thrombocytic lineage, whereas MRP5-expression was negatively correlated to CD41a. An intracellular signal, co-localized to LAMP-2 (dense-granule and lysosomal marker) was also found in thrombocytic differentiated cells. MRP4 and MRP5-expression in the myelomonocytic cells decreased with differentiation. For the leukemic cell lines a general increase of MRP4 and MRP5-expression was found with de-differentiation of the cells. Consequently, these transporters are differentially regulated during hematopoiesis in quality and quantity. These findings support the assumption that MRP4 plays an important role in thrombocytic metabolism, especially in mediator storage of cGMP, ADP and serotonin. Expression of transporters in the leukemic cell lines increases with de-differentiation. These findings lead to the therapeutic option of combining differentiation agents with chemotherapy to overcome multidrug resistance