Untersuchungen zum Aufbau eines Assays zur in vitro Selektion eines Cytidindesaminase-Ribozyms

In dieser Arbeit wurden Untersuchungen zur Funktionalisierung von RNAs im Hinblick auf die Selektion eines Ribozyms, das die Desaminierung von Cytidin zu Uridin katalysieren kann, durchgeführt. Die Desaminierung von Cytidin verläuft proteinkatalysiert. Cytidindesaminasen (CDAs) sind im Nukleotidmetabolismus aller Lebewesen zu finden. In höheren Eukaryoten spielen CDAs beim RNA editing eine Rolle. In Säugetieren sind sie bedeutsam für die Immunabwehr. Ein Cytidindesaminase-Ribozym wäre in der Lage die gezielte Veränderung einer RNA-Sequenz zu katalysieren. Diese Eigenschaft wäre ein weiteres Indiz für eine präbiotische RNA-Welt und könnte auch in der Gentherapie nützlich sein. Bei der in vitro Selektion ist die Funktionalisierung der RNA-Bibliothek ein zentraler Punkt. 5’-Transkriptionspriming ist dafür besonders gut geeignet, da es kotranskriptionell, während der Transkription der RNA, stattfindet. Während der Transkription kann die T7 RNA Polymerase ein 5’-modifiziertes Guanosinmonophosphat am 5’-Ende, also am Anfang einer RNA-Sequenz, einbauen. Cytidin, das zu prozessierende Substrat der Selektion, wurde mit einem Guanosinmonophosphat verbunden. Solche modifizierten Guanosinmonophosphat-Verbindungen werden Initiatormoleküle genannt, da sie nur zu Beginn einer RNA-Transkription am 5’-Ende einer RNA eingebaut werden können. Um eine Selektion zu ermöglichen, wurde das Cytidin mit einer Markierung versehen. Es wurden zwei verschiedene Initiatormoleküle synthetisiert. Der eine Initiator bestand aus einer Guanosinmonophosphateinheit und einer Cytidineinheit, die eine Biotinmarkierung trug. Die Biotinmarkierung ermöglicht eine Selektion an der festen Phase durch die starke Wechselwirkung von Biotin und Streptavidin. Bei erfolgreicher Reaktion der RNA wird diese von der Festphase getrennt und kann durch Waschen der Festphase isoliert werden. Der andere Initiator trug statt der Biotinmarkierung eine Fluoreszeinmarkierung. Die Selektion mit diesem Initiator würde in Lösung stattfinden. Fluoreszein-markierte RNAs besitzen eine andere gelektrophoretische Mobilität als unmarkierte RNAs. Bei der Selektion spalten aktive RNAs die Fluoreszeinmarkierung ab. Durch Gelaufreinigung der Selektionsansätze könnten sie so auf Grund ihrer veränderten gelelektrophoretischen Mobilität isoliert werden. Zur Synthese der Moleküle wurden zwei unterschiedliche Synthesestrategien entwickelt und angewandt. Die erste Synthesestrategie bediente sich der Phosphoramiditchemie an der festen Phase und lieferte den Biotin-markierten Initiator in nanomolaren Mengen. Die zweite Strategie führt zur Synthese des Fluoreszein-markierten Initiators und beinhaltete eine 18-stufige Synthese in Lösung, die eine Ausbeute des Initiators im µ-molaren Bereich ermöglichte. Die Funktionalisierung von RNA mit dem Biotin-markierten Initiator wurde qualitativ nachgewiesen mit Hilfe einer auf Northern Blotting und Chemilumineszenzdetektion aufbauenden Methode. Dabei wurden die Transkriptionsprodukte auf einer Nylonmembran immobilisiert und mit einem Fusionsprotein aus Alkalischer Phosphatase und Streptavidin zur spezifischen Bindungen an die Biotinmarkierung inkubiert. Durch Zugabe eines Substrats der Alkalischen Phosphatase wird ein Chemiluminszenzsignal induziert, welches mit einem empfindlichen Photosystem detektiert und dokumentiert werden kann. Der erfolgreiche Einbau der Fluoreszein-markierten Initiatormoleküle wurde qualitativ mit Hilfe denaturierender Gelelektrophorese und Fluoreszenzanregung bei einer Wellenlänge von 365 nm nachgewiesen. Zur quantitativen Bestimmung des Einbaus wurde eine auf fluoreszenzspektroskopischen Anwendungen basierende Methode etabliert und erfolgreich angewendet. Dazu wurde eine zu 100% 5’-Fluoreszein-markierte RNA mit Hilfe des Phosphoramiditverfahrens synthetisiert. Zur Erstellung einer Eichgerade mit dieser Referenz-RNA wurden Proben mit bekannten Konzentrationen mit Hilfe eines Fluoreszenzspektrophotometers vermessen. Die jeweiligen gemessenen Fluoreszenzintensitäten der Fluoreszenzemissionsmaxima der Proben wurden in einem Diagramm über der dazugehörigen Konzentration aufgetragen. Die so erstellte Eichgerade ermöglichte es anhand der gemessenen Fluoreszenzintensität einer Probe markierter RNAs die Konzentration der Probe zu ermitteln. Zur Bestimmung und Optimierung der Einbaueffizienz des Fluoreszein-markierten Initiators wurden Transkriptionspriming-reaktionen unter Variation der Transkriptionsbedingungen durchgeführt. Nach Optimierung der Reaktionsbedingungen wurde so eine Einbaurate von 18% erreicht. Die Ergebnisse dieser Arbeit dokumentieren, dass grundsätzlich beide Inititatormoleküle zur Funktionalisierung einer RNA-Bibliothek und den damit verbundenen Selektionsstrategien, Festphase oder Selektion in Lösung, angewendet werden können. Die Fluoreszein-basierende Selektionsstrategie hätte den Vorteil einer direkteren Identifizierung und spezifischeren Quantifizierung der funktionalisierten RNA-Bibliothek.This thesis describes the functionalization of ribonucleosides in order to examine the possibility to select a ribozyme which is able to catalyze the deamination of cytidine to uridine. In general the deamination of cytidine is protein-catalyzed. The reaction is important for various biochemical processes. Cytidine deaminases are involved in the nucleotide metabolism of every organism. In higher eucaryotes they are part of the RNA editing machinery and in mammals they play an important role in the immune system. A cytidine deaminase ribozyme would have the ability to alter an RNA sequence specifically. This property would provide another strong argument for a prebiotic RNA world (RNA world hypothesis) and might prove to be useful for gene therapy. For in vitro selection the functionalization of the necessary RNA library is an important step towards a succesfull selection. Functionalization at the 5’-end of RNA sequences can be accomplished by 5’-transcription priming. The T7 RNA polymerase is the most widely used enzyme for preparation of RNA by run-off transcription in vitro. It has been shown that 5’-modified guanosine derivatives are accepted instead of GTP as starting nucleosides in the initiation step of the transcription. These guanosine derivatives cannot be used during elongation, owing to the missing 5’-triphosphate. They are usually called inititator molecules. The substrate for the selection, cytidine, was therefore attached to a guanosine monophosphate. Additionally the cytidine was labelled with a tag, a requirement for the selection step. Two different initiator molecules were synthesized. The first initiator consisted of a guanosine monophosphate moiety and a cytidine moiety linked to biotin. The biotin label allows for a selection procedure involving immobilization of the biotinylated RNA library on a streptavidin-coated surface. An active RNA would cleave itself off the surface and could be isolated by washing the solid phase. The second initiator was labelled with fluorescein. By exchanging biotin for fluorescein the selection step would take place in solution. Fluorescein-labelled RNAs show a different gelelectrophoretic mobility than unlabelled RNAs. Active RNA molecules would cleave off the fluorescein tag and could be gel electrophoretically isolated. Two different synthetic strategies were employed to obtain the different initiator molecules. The first strategy relied on RNA solid phase synthesis using phosphoramidite chemistry and yielded the biotinylated initiator molecule in nanomolar amounts. The second strategy led to the synthesis of the fluorescein-labelled initiator molecule and involved a 18-step synthesis in solution which yielded the initiator in µmolar amounts. The functionalization of RNA with the biotinylated initiator was confirmed via Northern Blotting and a method based on chemiluminescence detection. The transcription products were immobilized on a nylon membrane and treated with a fusion protein consisting of alkaline phosphatase and streptavidin which reacts specifically with the biotin tag of the labelled RNA. Addition of a substrate of alkaline phosphatase triggers a chemiluminescence signal which was detected with a specific photo system. The successful incorporation of the fluorescein-labeled initiator molecule was verified via denaturing gel electrophoresis and fluorescence excitation at 365 nm. For the quantitative evaluation of the incorporation rate of the initiator molecule a fluorescence spectroscopic method was established. For this purpose a 100% 5’-fluorescein labelled RNA was generated via RNA solid phase synthesis. A standard curve was created by measuring known concentrations of the reference RNA spectrophotometrically with a fluorescence spectrophotometer. The quantified fluorescence intensities of the fluorescence emission maxima were plotted against the respective concentrations. The established standard curve allowed for determining the concentration of the amount of labeled RNA by measuring their fluorescence intensity. For quantification and optimization of the incorporation rate of the fluorescence-labelled initiator the transcription conditions were variied. After optimization an incorporation rate of 18% was achieved. The results of this thesis show that both initiator molecules can be used for the functionalization of a RNA library and therefore both selection strategies can be applied for the in vitro selection of a cytidine deaminase ribozyme. The fluorescein-based selection strategy would have the advantage of permitting a faster identification of the labelled RNA and a more specific method for the quantification of the amount of labeled RNA sequences