Studies on Specific and General Defense Strategies against Reactive Oxygen Species in 'Bacillus subtilis'

The present work consists of four parts, containing experimental data obtained from analysis of 'Bacillus subtilis' specific and general defense strategies against reactive oxygen species. In the first part, the peroxide and superoxide stress stimulons ob 'B. subtilis' were analyzed by means of transcriptomics and proteomics. Oxidative stress responsive genes were classified into two groups: the gene expression pattern was either similar after both stresses or the genes primarily responded to one stimulus. The high induction observed for members of the PerR-regulon after both stimuli supported the assumption that activation of the peroxide specific PerR-regulon represented the primary stress response after superoxide and peroxide stress. The second part focuses on protein carbonylation in 'B. subtilis' wild-type and 'sigB' mutant cells. The introduction of carbonyl groups into amino acid side chains of proteins represents one possible form of protein modification after attack by reactive oxygen species. Carbonyl groups are readily detectable and the observed amounts can thus serve as an indicator for the severity of protein damage. The resultsdemonstrate clearly that 'B. subtilis' proteins are susceptible to hydrogen peroxide (H2O2) mediated carbonylation damage. The application of low concentrations of H2O2 prior to the exposure to otherwise lethal levels of peroxide reduced markedly the degree of protein carbonylation, which also held true for glucose starved cells. Artificial preloading with general stress proteins resulted in a lower level of protein carbonylation when cells were subjected to oxidative stress, but no differences were detected between wild-type and 'sigB' mutant cells. In the third part, strains with mutations in genes encoding general stress proteins were screenedfor decreased resistance after H2O2 challenge. It was demonstrated that resistance to H2O2 challenge. It was demonstrated that resistance to H2O2 after transient heat treatment, likewise to conditions of glucose starvation, was at least partly mediated by the sB-dependent general stress response. The screening of mutants in sB-controlled genes revealed an important role for the deoxyribonucleic acid (DNA)-binding protein Dps in the context of sB-mediated resistance to oxidative stress underlining previous reports. Therefore, the experimental strategy opens a global view on the importance of DNA integrity in 'B. subtilis' under conditions of oxidative stress. The fourth part includes analysis of a 'B. subtilis' thioredoxin conditional mutant. The thiol-disulfide oxidoreductase TrxA is an essential protein in 'B. subtilis' that is suggested to be involved in maintaining the cytoplasmic thiol-disulfide state even under conditions of oxidative stress. To investigate the physiological role of TrxA, growth experiments and two-dimensional gel electrophoresis were carried out with exponentially growing cells that were depleted of TrxA. The observations indicate that TrxA essentially involved in the re-reduction of phosphoadenosyl phosphosulfate reductase CysH within the sulfate assimilation pathway of 'B. subtilis'.Die vorliegende Arbeit, bestehend aus vier Abschnitten, enthält experimentelle Daten aus Analysen der spezifischen und generellen Schutzstrategien von 'Bacillus subtilis' gegen reaktive Sauerstoffspezies. Im ersten Abschnitt ist die Analyse der Peroxid und Superoxid Stressstimulons von 'B. subtilis' anhand von Transkriptom- und Proteomdaten dargestellt. Gene, die auf oxidativen Stress reagieren, , konnten zwei Gruppen zugeordnet werden: entweder waren die Genexpressionsmuster nach Einwirkung beider Stressoren ähnlich, oder die Genexpression wurde nur durch einen der beiden Stimuli verändert. Die starke Induktion, die für Gene des PerR-Regulons nach beiden Stimuli beobachtet wurde, unterstützt die These, dass die Aktivierung des Peroxid-spezifischen PerR-Regulons die primäre Stressantwort nach Superoxid - und nach Peroxidstress darstellt. Der zweite Abschnitt enthält Daten zu Proteincarbonylierungen in Wildtyp- und 'sigB' Mutantenzellen von 'B. subtilis'. Die Reaktion von Aminosäureseitenketten zu Carbonyl-haltigen Derivaten stellt eine der möglichen Formen von Proteinmodifikationen nach Oxidation durch reaktive Sauerstoffspezies dar. Der Nachweis von Proteincarbonylierungen ist methodisch gut zugänglich und ermittelte Mengen können als Indikatoren für das Level der oxidativen Proteinschädigung herangezogen werden. Die Resultate belegen, dass Proteine von 'B. subtilis' nach Einwirkung von Hydrogenperoxid (H2O2) Carbonylierungsschäden aufweisen. Der Grad der Schädigung war weniger ausgeprägt, wenn Zellen vor einer lethalen Peroxidbehandlung mit niedrigen Konzentrationen von H2O2 vorbehandelt wurden oder einer zeitgleichen Glukoselimitation ausgesetzt waren. Nach künstlicher Beladung mit Generellen Stress Proteinen konnte ebenso eine erniedrigte Menge von Carbonylgruppen nach oxidativem Stress beobachtet werden, jedoch wurden keine Unterschiede zwischen Wildtyp- und Δ'sigB'-Zellen festgestellt. Im dritten Abschnitt wird die Analyse von Stämmen mit Mutationen in Sigmafaktor sB-regulierten Genen im Hinblick auf verringerte Resistenz gegenüber H2O2 beschrieben. Es konnte gezeigt werden, dass eine erhöhte Resistenz gegenüber H2O2 nach einer kurzzeitigen Temperaturerhöhung, ähnlich einer Glukoselimitation, zumindest teilweise auf der sB-vermittelten Generellen Stressantwort beruht. Durch die Analyse von Mutanten in sB-kontrollierten Genen konnte für das Desoxyribonukleinsäure-(DNS)-bindende Protein Dps eine wichtige Rolle innerhalb der sB-vermittelten Resistenz gegenüber H2O2 ermittelt werden, womit diese Resultate frühere Beobachtungen unterstützen. Die experimentelle Strategie eröffnet einen globalen Blick auf die Wichtigkeit der DNS-Integrität in 'B. subtilis' nach oxidativen Stress. Der vierte Abschnitt enthält Analysen einer 'B. subtilis' nach oxidativem Stress. Der vierte Abschnitt enthält Analysen einer 'B. subtilis' Thioredoxin Konditionalmutante. Die Thiol-Disulfid Oxidoreduktase TrxA ist ein essentielles Protein in 'B. subtilis', das vermutlich in die Aufrechterhaltung des zytoplastischen Thiol-Disulfid-Status auch unter oxidativen Stressbedingungen involviert ist. Die Untersuchung der Physiologischen Funktion von TrxA wurde mittels Wachstumsexperimenten und zweidimensionaler Gel Elektrophorese an Zellen durchgeführt, die kein TrxA Protein enthielten. Die Beobachtungen weisen auf eine essentielle Beteiligung von TrxA an der Re-Reduktion der Phosphoadenosyl Phosphosulfat Reduktase CysH innerhalb der Sulfat-Assimilation hin