Qualidade microbiológica de leite UHT brasileiro e biodiversidade genética de bactérias formadoras de esporos

Milk is considered a food rich in nutrients, which makes it the ideal environment for the development of a series of microorganisms. Among the milk contaminants microorganisms, which are able to form heat-resistant spores are very important, especially for dairy companies that use UHT technology. The genus Bacillus is the most associated with milk quality, and between the species of importance in the dairy industry, we can highlight Bacillus sporothermodurans. This bacterium is an aerobic mesophyll able to produce spores resistant to UHT treatment, and throughout the storage can germinate and multiply until counts close to 105 CFU∙mL-1. The objective of this study was to determine the microbiological quality of UHT milk commercialized in Brazil with a focus on the biodiversity of sporulated thermoresistant microorganisms. This work began with the evaluation of samples of UHT milk donated by seven different companies (A, B, C, D, E, F and G), of three regions of the country (South, Southeast and Midwest) over six months. For that the steps of incubation and total plate count were performed in accordance with the Ordinance no 370 of 1997 of Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. According to this Ordinance, which establishes that the count of aerobic mesophylls can not exceed the limit of 100 CFU∙mL-1, 50,5% of the samples evaluated were out of standards. After the seven days of incubation, two heat treatments (T1: 80 oC / 10 min and T2: 100 oC / 30 min) were applied to the inactivation of the vegetative cells and evaluation of the presence of sporulates. About five colonies were isolated from each sample and submitted to phenotypic characterization to identify the presence of B. sporothermodurans. For this, the analyzes were based on Normative Instruction n° 62 of 2003 of Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento in which each purified isolate was submitted to a series of biochemical tests (Gram staining, catalase, oxidase, anaerobic growth, glucose fermentation, esculin hydrolysis, nitrate reduction and urease test). According to the test results, none of the isolates obtained was considered B. sporothermodurans. Subsequently, the Rep-PCR analysis was carried out, which allowed grouping the isolates into clusters. After choosing, randomly, the representatives of each group, considering a similarity of 90%, these were sent to the 16S rDNA sequencing and it can be observed that the genus Bacillus was found in abundance corresponding to 100% of the isolates. Within the genus Bacillus six species were identified: Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus proteolyticus, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis and Bacillus velezensis. The identification of the presence of these sporulated bacteria in UHT milk samples indicates the importance of quality maintenance of raw material, the implementation of self-control programs, and the awareness of all links in the production chain in order to obtain a quality product.O leite é considerado um alimento rico em nutrientes, o que faz com que o mesmo seja o ambiente ideal para o desenvolvimento de uma série de micro-organismos. Entre os micro-organismos contaminantes do leite, aqueles capazes de formar esporos termorresistentes são muito importantes do ponto de vista microbiológico, principalmente, para laticínios que utilizam a tecnologia UHT. O gênero Bacillus é o mais associado com a qualidade do leite, e entre as espécies de importância na indústria de laticínios, podemos destacar Bacillus sporothermodurans. Essa bactéria é classificada como mesófila aeróbia e apresenta capacidade de produzir esporos resistentes ao tratamento UHT. Durante o armazenamento, estes esporos podem germinar, com subsequente multiplicação até contagens próximas de 105 UFC∙mL-1. O objetivo deste estudo foi determinar a qualidade microbiológica de amostras de leite UHT produzidas no Brasil com foco na biodiversidade de micro-organismos esporulados termorresistentes. Este trabalho teve início com a avaliação de amostras de leite UHT doadas por sete empresas distintas (A, B, C, D, E, F e G), de três regiões do país (Sul, Sudeste e Centro-oeste) ao longo de seis meses. Para tal, foram realizadas as etapas de incubação e contagem total em placas de acordo com a Portaria do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. De a Portaria no 370 de 1997, que estabelece que a contagem de mesófilos aeróbios não pode exceder ao limite de 100 UFC∙mL-1, 50,5% das amostras avaliadas encontraram-se fora dos padrões. A cada uma das amostras avaliadas foram aplicados dois tratamentos térmicos (T1: 80 oC/10 min e T2: 100 oC/30 min) para a inativação das células vegetativas e avaliação da presença de esporulados. Cerca de cinco colônias foram isoladas de cada amostra em estudo e submetidas à caracterização fenotípica para identificação da presença de B. sporothermodurans. Para isso as análises foram baseadas na Instrução Normativa n° 62 de 2003 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento na qual cada isolado purificado foi submetido a uma série de testes bioquímicos (coloração de Gram, catalase, oxidase, crescimento em anaerobiose, fermentação da glicose, hidrólise da esculina, redução do nitrato e prova da urease). De acordo com os resultados dos testes, nenhum dos isolados obtidos foi considerado B. sporothermodurans. Posteriormente, foi realizada a análise de Rep- PCR que permitiu agrupar os isolados em clusters. Após escolher, aleatoriamente, os representantes de cada grupo formado, considerando uma similaridade de 90%, estes foram enviados para o sequenciamento do rDNA 16S e pode-se observar que o gênero Bacillus, foi encontrado em abundância correspondendo a 100% dos isolados. Dentro do gênero Bacillus foram identificadas seis espécies: Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus proteolyticus, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis e Bacillus velezensis. A identificação da presença destas bactérias esporuladas nas amostras de leite UHT indica a importância da qualidade da matéria- prima, da implementanção dos programas de autocontrole, e da conscientização de todos os elos da cadeia produtiva, afim de obter um produto com qualidade.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológic